Выделение растворимых и нерастворимых олигомеров PrP в нормальном мозга человека

Целью этой процедуры является выделение растворимого и нерастворимого белка пиона или PRP всех связок в нормальном мозге человека. Это достигается путем гомогенизации ткани мозга человека и выделения фракций. Далее выполняется скоростное осаждение в сахарозе, ступенчатые градиенты.

Затем проводится эксклюзионная хроматография. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают выделение растворимых и нерастворимых PRP или связок из нормального человеческого мозга посредством ультрацентрифугирования в сахарозе, ступенчатых градиентов, размера, эксклюзионной хроматографии и захвата PRP с помощью G 5 P. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в исследовании предзаболеваний. в том числе создает дальнейшую болезнь Шакала, понтонную энцефалопатию БО и клинические истощающие заболевания. Кроме того, они могут дать представление об изоляции растворимых и нерастворимых белковых огасов не только при ионных заболеваниях, но и при других заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона.

Как правило, люди, плохо знакомые с этими методами, будут испытывать трудности, потому что все экспериментальные этапы важны, и они требуют особой осторожности. Видеодемонстрация этого сообщения имеет решающее значение, так как SEC Fi это глубина величия и захват PRP с G five P, эти шаги сложно назвать и это может быть справедливо без более точной работы. Чтобы приготовить гомогенат мозга, начните с добавления 100 микролитров буфера для лизиса к 100 миллиграммам замороженной мозговой ткани с помощью моторизованного пестика, гомогенизируйте ткань на льду, заморозьте ее на сухом льду на пять минут и снова гомогенизируйте.

Сделайте гомогенат мозга на 20% или 10%, добавив 300 или 800 микролитров буфера для лизиса соответственно. Используя настольную центрифугу, вращайте гомогенат при 1000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Соберите SNA в роторной центрифуге S SW 55 с одной фракцией при 35 000 об/мин в течение одного часа при четырех градусах Цельсия.

Переложите супинат в чистую пробирку Resus. Суспензируйте нерастворимую гранулу моющего средства в лизисном буфере для подготовки образцов для вестерн-блоттинга. Инкубируйте фракции S-2 и P-2 с 50 микрограммами на миллилитр протеиназы К в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия.

Завершите разложение, добавив пять миллимолярных PMSF и буфер для образцов SDS. Прокипятите образцы в течение 10 минут и вызывайте их при комнатной температуре в течение пяти минут Чтобы выполнить скоростное осаждение, начните с инкубации 450 микролитров 20%S одной фракции с равным объемом 2% воды Sarco X на льду в течение 30 минут до пяти миллилитровых центрифужных пробирок. Добавьте по 0,5 миллилитров из 60, 30, 25, 20, 15 и 10% сахарозы, загрузите по 0,4 миллилитра инкубатора S один на верх от 10 до 60% сахарозы.

Центрифуга ступенчатого градиента в роторе SW 55 со скоростью 48 000 об/мин в течение одного часа при четырех градусах Цельсия от верхней части пробирки. Соберите 12 равных фракций по 283 микролитра каждая. Используйте по 20 микролитров из каждой фракции и равный объем буфера для проб SDS.

Для подготовки SDS страницы образцы геля. Варите образцы в течение 10 минут, затем вызывайте их в течение четырех минут. Центрифугируйте образцы при 1000 G в течение одной минуты.

на них вихревую обработку перед загрузкой в сборное исключение размера геля. Хроматография используется для определения олигомерного состояния молекул PRP. Начните с загрузки 200 микролитров семи отдельных маркеров молекулярной массы в колонку SUEx 200 HR размером один на 30.

Используйте элюцианский объем синего декстрана в качестве пустого объема. Рассчитайте пиковые элюцианские объемы ЖЭ по хроматограмме и фракционным ретенциям. Рассчитайте KAV коэффициент разбиения по уравнению KAV равно V минус V ноль над VT минус V ноль.

Для создания калибровочной кривой. Соотнесите KAV белковых стандартов с логарифмической молекулярной массой стандартов. Далее внесите в колонку 200 микролитров S one со скоростью расхода 0,25 миллилитров в минуту.

Промыть колонку с помощью лизиса буфером 1%-ной и с помощью сборника фракций вымыть 0,25 миллилитровых фракций. Инкубируйте по 125 микролитров из каждой фракции с 500 микролитрами предварительно охлажденного метанола при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение двух часов. Центрифугируйте образцы при 13 000 G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия.

Риз, согнуть гранулу в 20 микролитрах SDS, образец буфера прокипятить 10 минут. Позвоните до комнатной температуры и разрешите на 15% полиакриламидных гелях. Используйте стандартную кривую для экстраполяции молекулярных масс различных восстановленных форм PRP для конъюгации молекулы G 5 P с магнитными шариками.

Инкубируйте 100 микрограммов G 5 P с 350 микролитрами активированных тоци магнитных шариков в одном миллилитре PBS при 37 градусах Цельсия в течение 20 часов. С помощью внешнего магнита притяните шарики G five P к боковой стенке пробирок Эппендорфа и удалите раствор. Промойте бусины три раза одним миллилитром PBS 0,1% BSA, чтобы блокировать неспецифическое связывание.

Инкубируйте сопряженные шарики G five P в одном миллилитре 0,2 моло триса, HCL pH 7,4, содержащем 0,1% BSA, в течение пяти часов при 37 градусах Цельсия. Затем вымойте бусины три раза. Удалите последнюю промывку и добавьте один миллилитр PBS для выделения PRP, инкубируйте 100 микролитров S 1 или P 2 с 60 микролитрами G пяти B, сопряженных шариков в одном миллилитре связующего буфера при постоянном вращении в течение трех часов комнатной температуры.

Поместите трубку на магнит. Удалите раствор и трижды промойте шарики с помощью буфера для промывки. Удалите окончательную промывку и добавьте буфер для образцов SDS.

Нагрейте бусины при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут. Загрузите образцы в 15% сборные гели и работайте при напряжении 150 вольт в течение 80-80 минут. Перенесите белки в PVDF при напряжении 70 вольт в течение двух часов после блокировки мембран в 5%-ном молоке в TBST.

Инкубируйте их в течение двух часов при комнатной температуре с антителами PRP. Три F, четыре, один E, четыре анти N или анти C после инкубации с конъюгированными HRP вторичными антителами инкубируют мембрану и раствор хемилюминесценции в соответствии с инструкциями производителя и подвергают пленку воздействию как показано здесь, сравнивая со спорадическими образцами клапана CRUT, болезнью Якко или болезнью Крейцфельда-Якоба. Небольшое количество нерастворимого клеточного PRP было обнаружено в фракции P two от нормального мозга.

Тем не менее, большая часть была извлечена в двух фракциях S. Нерастворимые PRP составляют примерно от 5 до 25% от общего объема PRP, включая полноразмерные и концевые терминальные усеченные анализы видов с использованием ступенчатого осаждения сахарозы показали, что в то время как большая часть PRPC из мозга, не относящегося к болезни Крейцфельда-Якоба, была обнаружена в верхних фракциях, одно три небольших количества PRP также были обнаружены в нижних фракциях 911, которые обычно содержат большие агрегаты. Разнообразие патогенных видов PRP или PRP SC, начиная от мономеров.

Меньшие связки и более крупные агрегаты были выделены с помощью гелевой фильтрации в головном мозге при болезни клапана CRUT yakup. Удивительно, но небольшое количество более крупных агрегатов с молекулярным следом более 2000 килодальтон было обнаружено и в нерастворимых фракциях нормального мозга. Более того, димеры и тетрамеры PRPC были обнаружены не только в нерастворимых, но и в нерастворимых фракциях.

После лечения ФК и НГА. PRP, захваченный G five P, был обнаружен с помощью одного антитела E four против PRP 97 1 0 5 3. Были обнаружены устойчивые к ПК фрагменты ядра, получившие обозначения звездочка PRP 20, звездочка PRP 19 и звездочка PRP 7, мигрирующие на расстоянии 20 килодальтон Доусона, 19 килодальтон и семи килодальтон соответственно.

Тем не менее, PRP не было обнаружено, когда антитело One E four было предварительно инкубировано с синтетическим пептидом, который имеет последовательность, идентичную эпитопу One E four, что указывает на то, что полосы, обнаруженные одним E 4, являются фрагментами PRP. Антитело против С обнаружило два различных фрагмента PRP, мигрирующих со скоростью около 18 килодальтон и от 12 до 13 килодальтон. В дополнение к методу PRP ETE 20 Once.

Эту методику можно сделать за четыре дня, если она выполнена правильно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выделить растворимую и нерастворимую полигамную PRP в нижнем мозге человека после ее развития. Этот метод проложил путь к исследованиям в судьбе до того, как можно было изучить информацию о подтверждении PIP в мозге.