Karşı Antibiyotik Etkinlik Test Yapay Balgam Orta Kullanımı Pseudomonas aeruginosa Kistik Fibrozis Akciğer Daha İlgili Koşullar

Bu deneyin amacı, kistik fibroz akciğerdeki kronik enfeksiyonları temsil eden koşullar altında, tanımlanmış bir yapay balgam ortamı kullanarak pseudomonas Aerogen biyofilmlerine karşı antibiyotiklerin etkinliğini değerlendirmektir. Bakteriyel biyofilmler 24 yılında büyütülür. Peki mikrotitre plakaları.

Biyofilmler daha sonra antibiyotiklere maruz bırakılır. Daha sonra, antibiyotikle muamele edilen kültürler selülaz kullanılarak bozulur ve canlı hücreler tarafından maviden pembeye indirgenen metabolik bir boya srin ile inkübe edilir. Kuyucukların absorbansını ölçerek, yakın fizyolojik koşullar altında antibiyotik duyarlılığını ölçmek için biyofilm Cecile hücresi minimum B-S-M-I-C inhibitör konsantrasyonu belirlenebilir.

Bu tekniğin, planktonik kültüre dayalı minimum inhibitör konsantrasyonların belirlenmesi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bakterilerin balgamın tüm bileşenlerini içeren özel bir ortamda büyümesi ve böylece biyofilm oluşumunu teşvik etmesidir. Bu biyofilmler antibiyotiklere karşı çok daha dirençlidir. Ortamı yapmak için, önce ilk şişede 250 mililitre steril su içeren iki şişe hazırlayın.

Yavaş yavaş karıştırın ve ardından 250 mililitre steril suya dört gram balık spermi, DNA ekleyin. Çözeltiyi oda sıcaklığında karıştırın ve DNA'nın ikinci şişeye çözünmesine izin verin. Yavaş yavaş domuz midesinden beş gram tip iki müsin ekleyin ve karıştırın.

DNA ve müsin çözeltileri hazır olduğunda, amino asitleri 100 mililitre steril suda çözün, sırasıyla 25 mililitre suda veya 25 mililitre 0.5 molar potasyum hidroksitte çözülmesi gereken L tirozin ve L sistein hariç. Daha sonra, 100 mililitre suda 5.9 miligram DTPA, beş gram sodyum klorür ve 2.2 gram potasyum klorür yapar. Tüm farklı çözeltileri bir litrelik şişede birleştirin, ardından beş mililitre yumurta sarısı emülsiyonu ekleyin ve karışımı 850 mililitreye kadar suyla doldurun.

Bir molar triss kullanarak, pH'ı 6.9'a ayarlayın ve ortamı sterilize etmek için son hacmi suyla bir litreye getirin, bir vakum markası ME iki diyaframlı vakum pompası ve 45 milimetre boyunlu bir Millipore stereo üst filtre ünitesi kullanarak filtreleyin ve 0.2 mikron gözenek boyutu. Filtrasyon işlemi iki gün boyunca gerçekleştirilebilir. A SM besiyeri, bir aya kadar dört santigrat derecede saklanabilir.

0.05'lik bir OD elde etmek için gece boyunca pseudomona arosa kültürlerini LB ortamında seyrelterek başlayın. Daha sonra bakterileri bir SM orta plakasında bir ila 100 arasında daha da seyreltin, 24 oyuklu bir doku kültürü plakasının 21 oyuğunda seyreltilmiş bakteri kültürü kuyusu başına 1.8 mililitre, kalan üç oyukta aynı hacimde bir SM ortamı alikot, bu da boş negatif kontroller olarak işlev görecektir. 24 kuyulu plakayı biyofilm ile sabitleyin ve biyofilmlerin oluşmasına izin vermek için, büyük anaerobik kavanozlarda kampi gen gaz üretim paketleri kullanılarak elde edilebilecek mikro hata dolgu koşulları altına yerleştirin.

Kültürü, üç gün boyunca 37 santigrat derecede üç gün boyunca 75 RPM'ye ayarlanmış bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin, biyofilmler bakteri hücreleri içeren jelatinimsi bir kütle olarak görünecek ve pipetleme ile bozulamaz. Biyofilmler, seri olarak seyreltilmiş konsantrasyonlarda antibiyotik kuyusu başına 200 mikrolitrede oluşturulduktan sonra. Test edilecek her ilaç konsantrasyonu için en az dört kopya kurduğunuzdan ve negatif kontroller olarak kullanılabilmeleri için biyofilm içeren dört kuyucuğu tedavi edilmeden bıraktığınızdan emin olun.

Daha sonra, antibiyotiklerle inkübasyonu takiben plakaları daha önce 24 saat daha inkübe edin. Biyofilmleri bozmak için sitrat tamponunda mililitre başına 100 miligrama seyreltilmiş selülaz kuyusu başına 100 mikrolitre kullanın, plakaları bir saat boyunca aerobik koşullar altında 37 santigrat derecede 150 RPM'ye ayarlanmış bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Bu inkübasyon kılavuzunu takiben, ortamda hücre kümeleri görünüyorsa, biyofilmleri daha fazla ayrıştırmak için pipetleme kullanılabilir.

Daha sonra, biyofilmlerden salınan hücrelerin canlılığını ölçmek için kuyu başına 100 mikrolitre rezin ekleyin ve hücreleri bir ila iki saat inkübe edin. 37 santigrat derecede, sadece canlı hücreler mavi zarin boyasını pembe floresan formuna metabolize edebilir. İnkübasyonun ardından, numuneleri 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve beş adet 40 nanometre uyarma dalga boyu ve beş adet 90 nanometre emisyon dalga boyu kullanarak kuyuların floresansını ölçün.

Bakteriyel canlılığı ve ilaç duyarlılığını ölçmek için, önce boş kontrolün arka plan floresansını diğer kuyucuklardan çıkarın. Daha sonra, her konsantrasyon için ortalama floresansı, işlenmemiş kontrollerin ortalama floresansına bölerek ve 100 ile çarparak inhibisyon yüzdesini hesaplayın. B-S-M-Y-C, bu elektron mikrograflarında gösterildiği gibi metabolik aktivitenin% 90'lık bir inhibisyonuna neden olan antibiyotik konsantrasyonu olarak tanımlanır, biyofilmlerde büyütülen hücreler, planktonik kültürlerde yetiştirilen bakterilerden önemli ölçüde farklıdır.

Özellikle, sarı ile gösterilen büyük miktarlarda hücre dışı matriks, biyofilmdeki hücreleri yeşil renkle çevreler, ancak planktonik kolonilerde değil. Ek olarak, biyofilmlerdeki bakteriler bu deneyde tipik olarak antibiyotiklere karşı daha dirençlidir. Mavi renkteki pseudomonas aerojen planktonik kültürü için minimum tobramisin inhibitör konsantrasyonu mililitre başına yaklaşık dört mikrogram olarak belirlenmiştir.

Buna karşılık, kırmızı ile gösterildiği gibi, biyofilmlerdeki bakterilerin %100'ü mililitre antibiyotik başına 512 mikrograma kadar hayatta kalmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, tanımlanmış bir yapay balgam ortamında bakterilerin nasıl kültürleneceğini iyi anlamış olmalısınız. Ayrıca, kistik fibrozis akciğerinde daha gerçekçi bir ortamda bakteri üremesini engellemek için gereken minimum inhibitör konsantrasyonu belirlemek için bir antibiyotik duyarlılık testi yapabilmelisiniz.