التصوير المتعدد الوسائط من زرع الخلايا الجذعية في الجهاز العصبي المركزي من الفئران

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحقيق متابعة معيارية لسلوك الخلايا الجذعية المزروعة في دماغ الفأر داخل الجسم الحي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق وسم الخلايا السدوية المشتقة من نخاع العظم، والتي تعبر بشكل مشترك عن EGFP واللوسيفيراز، باستخدام جزيئات أكسيد الحديد الفلورية ذات الحجم الميكروني. تتمثل الخطوة الثانية في حقن الخلايا الجذعية لنخاع العظم (BMCs) الموُسمة بـ MPIO بشكل مناسب في أنسجة دماغ الفأر.

بعد ذلك، يتم تتبع بقاء وتمركز الطعوم الخلوية بطريقة غير جراحية باستخدام التصوير بالتلألؤ البيولوجي والتصوير بالرنين المغناطيسي. وتتمثل الخطوة النهائية في التحقق من نتائج التصوير داخل الجسم الحي باستخدام التحليل النسيجي بعد الوفاة. يمكن لهذه الطرق أن توفر رؤية حول سلوك الخلايا الجذعية بعد زراعتها في دماغ الفأر، كما يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى مثل الكائنات النموذجية ودراسات الأمراض.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن خطوات التعامل مع الحيوانات يصعب تعلمها، نظراً لأن الحقن الوريدي والحقن داخل الدماغ يصعب تنفيذهما وينطويان على مخاطر معينة تؤثر على بقاء الحيوان. لبدء هذا الإجراء، أضف 75 times 10 to the six من جزيئات أكسيد الحديد ذات الحجم الميكروني وباللون الأزرق الجليدي إلى مزرعة خلوية نامية غير متلاقية. قم بتحضينها لمدة 16 ساعة أخرى للسماح بامتصاص الجزيئات عبر عملية الإدخال الخلوي، ثم اغسل الجزيئات المتبقية.

اترك الخلايا تنمو لمدة 24 ساعة إضافية للحصول على تلاقي خلوي وتوزيع متجانس لـ G-B-M-P-I-O. بعد ذلك، استخدم المجهر الفلوري للتحقق بصرياً من امتصاص الجسيمات عن طريق حساب نسبة الخلايا الموجبة لـ EGFP والموجبة لـ G-B-M-P-I-O إلى العدد الإجمالي للخلايا الموجبة لـ EGFP. بعد ذلك، اغسل خلايا BMSC luciferase EGFP الموصومة بـ G-B-M-P-I-O مرتين باستخدام 10 milliliters.

عالج الخلايا بـ PBS ثم بـ tripsin EDTA وقم بحصادها بعد ذلك. اغسل الخلايا بعد ذلك وأعد تعليقها بتركيز نهائي قدره 133 × 10⁶ خلية/مل في PBS. وأخيرًا، احفظ الخلايا على الثلج حتى يحين وقت الزرع.

في هذا الإجراء، يتم تخدير الفأر عن طريق الحقن داخل الصفاق بمزيج من الكيتامين بتركيز 80 milligrams per kilogram والزيلازين بتركيز 16 milligrams per kilogram. انتظر لمدة خمس دقائق حتى ينام الفأر، ثم قم بحلاقة رأسه للسماح بإجراء عمليات تعقيم. بعد ذلك، ضع الفأر في إطار التوجيه المجسم، وقم بتطهير الجلد باستخدام الكحول.

بعد ذلك، ضع مرهمًا في عيني الحيوان لمنع الجفاف. قم بإجراء شق في خط منتصف فروة الرأس للكشف عن الجمجمة من أجل استهداف الحصين. احفر ثقبًا في الجمجمة على مسافة 2 mm خلفيًا و 2 mm جانبيًا باستخدام مثقاب الأسنان.

في هذه المرحلة، قم برجّ معلق الخلايا باستخدام جهاز الـ vortex لفترة وجيزة، ثم اسحب معلق الخلايا في المحقنة. بعد ذلك، اخفض إبرة المحقنة إلى عمق 2.5 مليمتر تحت الأم الجافية واترك الضغط ليتوازن لمدة دقيقة واحدة. بعد مرور دقيقة، اسحب الإبرة إلى وضعية تبعد مليمترين تحت الأم الجافية.

ثم احقن 3 µL من معلق الخلايا باستخدام مضخة حقن دقيقة آلية بسرعة 0.70 µL/min. بعد الحقن، انتظر لمدة خمس دقائق إضافية لمنع التدفق العكسي لمعلق الخلايا المحقون. بعد ذلك، اسحب الإبرة ببطء.

بعد ذلك، يتم تطهير حواف الجلد، ثم خياطة الجلد. يُحقن 300 µL من محلول sodium chloride بتركيز 0.9% تحت الجلد لمنع الجفاف. وفي النهاية، يوضع الفأر تحت مصباح تدفئة للسماح له بالإفاقة من التخدير لإجراء التصوير بالتلألؤ البيولوجي.

قم بتخدير الفأر باستخدام خليط من 3% iso-flurane والأكسجين. ثم ضع الفأر في جهاز التصوير الفوتوني. قلل مستوى التخدير عن طريق ضبط تركيز الـ iso-flurane إلى 1.5%. بعد ذلك، احقن d-Luciferine وريدياً بجرعة 150 mg/kg من وزن الجسم.

قم بالتقاط الصور لمدة خمس دقائق باستخدام برنامج photo vision. بعد ذلك، أجْرِ معالجة الصور باستخدام برنامج M three vision وقم بقياس الإشارة المرصودة باستخدام مناطق اهتمام محددة. ولإجراء التصوير بالرنين المغناطيسي، قم بتخدير الفأر باستخدام 3% ISO fluorine في خليط من الأكسجين وأكسيد النيتريك.

ثم ضع الفأر في أداة التثبيت الخاصة بنظام الرنين المغناطيسي الأفقي بقوة 9.4 Tesla. قم بخفض مستوى التخدير عن طريق ضبط تركيز isof fluorine إلى 1%. بعد ذلك، ضع مرهماً على عيني الفأر لمنع الجفاف. ومن ثم، استخدم مسباراً شرجياً لمراقبة درجة حرارة الجسم.

بعد ذلك، ضع مستشعراً أسفل بطن الفأر لمراقبة معدل التنفس. حافظ على معدل التنفس عند 110 ± 10 مرة في الدقيقة، وأبقِ درجة حرارة الجسم ثابتة ضمن نطاق ضيق يبلغ 37 ± 0.5 درجة Celsius. ثم ضع ملف RF السطحي فوق رأس الفأر.

ضع الفأر في منتصف المغناطيس. بعد ذلك، افتح برنامج ParaVision 5.1. قم بضبط معاملات التسلسل وفقاً للمخطوطة المرفقة. ثم قم بالحصول على مجموعة من 10 صور مقطعية إكليلية بوزن T2 باستخدام صدى الدوران (spin echo) من أجل الحصول على معلومات تشريحية محددة.

التقط صور صدى متدرج موزونة بنجمتين (two star weighted gradient echo images) لدراسة هجرة الخلايا الجذعية بدقة مستوية تبلغ 70 micrometers squared. في هذه الخطوة، يتم تضحية الفأر وإزالة الدماغ. ثم يتم تثبيت أنسجة الدماغ في درجة حرارة الغرفة باستخدام 4%paraldehyde في PBS لمدة ساعتين.

بعد مرور ساعتين، يتم تجفيف أنسجة الدماغ عن طريق وضعها في تراكيز متدرجة من السكروز عند درجة حرارة 4 °C. وفي اليوم التالي، يتم تجميد أنسجة الدماغ باستخدام النيتروجين السائل وتُحفظ الأنسجة عند درجة حرارة -80 °C حتى يحين موعد التقطيع.

قم بتقطيع نسيج الدماغ إلى مقاطع بسمك 10 ميكرومتر باستخدام جهاز الميكروتوم المجمد (cryostat). بعد ذلك، افحص المقاطع المجمدة غير المصبوغة تحت مجهر فلوري للكشف عن الفلورة الزرقاء الناتجة عن جسيمات G-B-M-P-I-O والفلورة الخضراء الناتجة عن الخلايا التي تعبر عن EGFP. ثم افحص المقاطع المجمدة غير المصبوغة للكشف عن الفلورة الخلفية ذات اللونين الأخضر والأحمر الناتجة عن الخلايا الالتهابية.

تؤدي إجراءات وسم الخلايا الجذعية الميزنكيمية في نخاع العظم (BMSC) والخلايا التي تعبر عن luciferase EGFP باستخدام MPIO glacial blue الموصوفة إلى وسم عالي الكفاءة، وهو ما يمكن التحقق منه بسهولة بواسطة المجهر الفلوري. بعد ذلك، وعند تطعيم خلايا BMSC وluciferase EGFP الموُسمة بـ G-B-M-P-I-O في الجهاز العصبي المركزي للفئران، يمكن مراقبة بقاء الطعم الخلوي عن طريق التصوير بالتلألؤ البيولوجي في الجسم الحي استناداً إلى نشاط luciferase. بالإضافة إلى ذلك، يمكن مراقبة التموضع الدقيق للخلايا المطعمة عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي في الجسم الحي استناداً إلى محتوى الحديد في MPIO glacial blue.

وأخيراً، يظهر التحليل النسيجي التحقق من صحة النتائج التي تم الحصول عليها عن طريق التصوير بالتلألؤ البيولوجي والتصوير بالرنين المغناطيسي. كما تم تأكيد البقاء المستقر للخلايا من خلال التعبير المستقر لبروتين EGFP بمرور الوقت بعد تطويره. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التصوير الجزيئي لاستكشاف الأحداث الخلوية والجزيئية بعد زراعة الخلايا الجذعية في نماذج حيوانية مختلفة للأمراض التنكسية العصبية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء التصوير الجزيئي، بتطبيق التصوير بالتلألؤ البيولوجي والتصوير بالرنين المغناطيسي، والتحقق بشكل كافٍ من النتائج في الجسم الحي باستخدام التقييم النسيجي بعد الوفاة.