Name: ラットの精巣挙筋の虚血再灌流障害における白血球 - 内皮相互作用のリアルタイムデジタルイメージング（IRI） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 7 s
Description: 学ぶラットの精巣挙筋における虚血再灌流障害のリアルタイムイメージング手法。白血球と血管内皮細胞の相互作用を可視化し、炎症反応のメカニズム解明に役立つ実験プロトコルを詳しく解説します。

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この作品は、SU Eisenhardtに &quot;ドイツ学術振興&quot;（EI 866/1-1）の助成金によって支えられている。

<ol><li>Cetin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+fucoidin+%28a+neutrophil+rolling+inhibitor%29+on+ischemia+reperfusion+injury%3A+experimental+study+in+rat+epigastric+island+flaps%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Plast.+Surg%22%5BJournal%5D)">Protective effect of fucoidin (a neutrophil rolling inhibitor) on ischemia reperfusion injury: experimental study in rat epigastric island flaps.</a> Ann. Plast. Surg. 47, 540-546 (2001).</li>
<li>Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+xanthine+oxidase+and+granulocytes+in+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of xanthine oxidase and granulocytes in ischemia-reperfusion injury.</a> Am. J. Physiol. 255, H1269-H1275 (1988).</li>
<li>Lazarus, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mast+cells+in+ischaemia-reperfusion+injury+in+murine+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">The role of mast cells in ischaemia-reperfusion injury in murine skeletal muscle.</a> J Pathol. 191, 443-448 (2000).</li>
<li>van den Heuvel, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Ischaemia-reperfusion+injury+in+flap+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plast.+Reconstr.+Aesthet.+Surg%22%5BJournal%5D)">Review: Ischaemia-reperfusion injury in flap surgery.</a> J. Plast. Reconstr. Aesthet. Surg. 62, 721-726 (2009).</li>
<li>Rosen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+lectins+in+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cell surface lectins in the immune system.</a> Semin. Immunol. 5, 237-247 (1993).</li>
<li>van der Flier, A., Sonnenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+and+interactions+of+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Function and interactions of integrins.</a> Cell Tissue Res. 305, 285-298 (2001).</li>
<li>Panes, J., Perry, M., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-endothelial+cell+adhesion%3A+avenues+for+therapeutic+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-endothelial cell adhesion: avenues for therapeutic intervention.</a> Br. J. Pharmacol. 126, 537-550 (1999).</li>
<li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research%3A+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li>
<li>Sutton, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+of+the+renal+microvascular+endothelium+alters+barrier+function+after+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Injury of the renal microvascular endothelium alters barrier function after ischemia.</a> Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 285, 191-198 (2003).</li>
<li>Serracino-Inglott, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+nitric+oxide+synthase+expression+during+hepatic+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Differential nitric oxide synthase expression during hepatic ischemia-reperfusion.</a> Am. J. Surg. 185, 589-595 (2003).</li>
<li>Eppinger, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediators+of+ischemia-reperfusion+injury+of+rat+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mediators of ischemia-reperfusion injury of rat lung.</a> Am J Pathol. 150, 1773-1784 (1997).</li>
<li>Dumont, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+apoptotic+cell-membrane+changes+at+the+single-cell+level+in+the+beating+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of apoptotic cell-membrane changes at the single-cell level in the beating murine heart.</a> Nat Med. 7, 1352-1355 (2001).</li>
<li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc Res. 5, 384-394 (1973).</li>
<li>Woeste, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Octreotide+attenuates+impaired+microcirculation+in+postischemic+pancreatitis+when+administered+before+induction+of+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Octreotide attenuates impaired microcirculation in postischemic pancreatitis when administered before induction of ischemia.</a> Transplantation. 86, 961-967 (2008).</li>
<li>Schultz, J. E., Hsu, A. K., Gross, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+mimics+the+cardioprotective+effect+of+ischemic+preconditioning+via+a+glibenclamide-sensitive+mechanism+in+the+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Morphine mimics the cardioprotective effect of ischemic preconditioning via a glibenclamide-sensitive mechanism in the rat heart.</a> Circ. Res. 78, 1100-1104 (1996).</li>
<li>Dobschuetz, E. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+intravital+fluorescence+microscopy--a+novel+method+for+the+assessment+of+microvascular+permeability+in+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic intravital fluorescence microscopy--a novel method for the assessment of microvascular permeability in acute pancreatitis.</a> Microvasc Res. 67, 55-63 (2004).</li>
<li>Vutskits, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adverse+effects+of+methylene+blue+on+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Adverse effects of methylene blue on the central nervous system.</a> Anesthesiology. 108, 684-692 (2008).</li>
<li>Takasu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival+time+with+combined+early+blood+transfusion+and+fluid+administration+in+uncontrolled+hemorrhagic+shock+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Trauma%22%5BJournal%5D)">Improved survival time with combined early blood transfusion and fluid administration in uncontrolled hemorrhagic shock in rats.</a> J. Trauma. 8, 312-316 (2010).</li>
<li>Proctor, K. G., Busija, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+among+arteriolar%2C+regional%2C+and+whole+organ+blood+flow+in+cremaster+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle.</a> Am. J. Physiol. 249, 34-41 (1985).</li>
<li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mouse+Cremaster+Muscle+Preparation+for+Intravital+Imaging+of+the+Microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation.</a> J. Vis. Exp. (52), e2874(2011).</li>
<li>Kanwar, S., Hickey, M. J., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postischemic+inflammation%3A+a+role+for+mast+cells+in+intestine+but+not+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Postischemic inflammation: a role for mast cells in intestine but not in skeletal muscle.</a> Am. J. Physiol. 275, 212-218 (1998).</li>
<li>Leoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflamed+phenotype+of+the+mesenteric+microcirculation+of+melanocortin+type+3+receptor-null+mice+after+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Inflamed phenotype of the mesenteric microcirculation of melanocortin type 3 receptor-null mice after ischemia-reperfusion.</a> FASEB J. 22, 4228-4238 (2008).</li>
<li>Simoncini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+oestrogen+receptor+with+the+regulatory+subunit+of+phosphatidylinositol-3-OH+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interaction of oestrogen receptor with the regulatory subunit of phosphatidylinositol-3-OH kinase.</a> Nature. 407, 538-541 (2000).</li>
<li>Woollard, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+levels+of+soluble+P-selectin+mediate+adhesion+of+leukocytes+to+the+endothelium+through+Mac-1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation.</a> Circ. Res. 103, 1128-1138 (2008).</li>
<li>Mori, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-reperfusion+induced+microvascular+responses+in+LDL-receptor+-%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ischemia-reperfusion induced microvascular responses in LDL-receptor -/- mice.</a> Am. J. Physiol. 276, H1647-H1654 (1999).</li>
<li>Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+Molecular+Changes+Induced+by+Ischemia%2FReperfusion+in+Human+Free+Muscle+Flap+Tissue+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Plast.+Surg%22%5BJournal%5D)">Monitoring Molecular Changes Induced by Ischemia/Reperfusion in Human Free Muscle Flap Tissue Samples.</a> Ann. Plast. Surg. , (2011).</li>
<li>Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+activation-specific+human+anti-%7Balpha%7DM%7Bbeta%7D2+single-chain+antibodies+as+potential+diagnostic+tools+and+therapeutic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of activation-specific human anti-{alpha}M{beta}2 single-chain antibodies as potential diagnostic tools and therapeutic agents.</a> Blood. 109, 3521-3528 (2007).</li>
<li>Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+pentameric+to+monomeric+C-reactive+protein+on+activated+platelets+localizes+inflammation+to+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Dissociation of pentameric to monomeric C-reactive protein on activated platelets localizes inflammation to atherosclerotic plaques.</a> Circ Res. 105, 128-137 (2009).</li>
<li>Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-reactive+protein%3A+how+conformational+changes+influence+inflammatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">C-reactive protein: how conformational changes influence inflammatory properties.</a> Cell Cycle. 8, 3885-3892 (2009).</li>
<li>Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGranger%2C+DN+%22Physiology+and+pathophysiology+of+leukocyte+adhesion%22">Physiology and pathophysiology of leukocyte adhesion</a>. , Oxford University Press. New York. 520(1995).</li>
<li>Baatz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+white+blood+cell+staining+by+intravascular+administration+of+rhodamine+6G%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Microcirc.+Clin.+Exp%22%5BJournal%5D)">Kinetics of white blood cell staining by intravascular administration of rhodamine 6G.</a> Int. J. Microcirc. Clin. Exp. 15, 85-91 (1995).</li>
<li>Mempel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).</li>
<li>Abbitt, K. B., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fluorescent+dyes+on+selectin+and+integrin-mediated+stages+of+adhesion+and+migration+of+flowing+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Effects of fluorescent dyes on selectin and integrin-mediated stages of adhesion and migration of flowing leukocytes.</a> J. Immunol. Methods. 239, 109-119 (2000).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

白血球-内皮相互作用、活性酸素種の産生および補体系の活性化IRI-誘発組織障害の主要な特徴である26は、罹患組織の微小循環は、炎症の発症の積分サイトと見なされます。別にそのようなフローチャンバーアッセイとしてex vivoでの実験を27日、28日からは、さらにin vivoでの関連で評価するために生体内イメージングの定評のあるモデルを提供するために必須です。 IRIは、さまざまな器官系に関与しているのに、ここではフラップ手術（ 図1）したがって、特に関連し、体系的に第一バエズら13により記述されていた横紋筋組織の再灌流障害における白血球-内皮相互作用を調べるための方法を説明します。 29それは他の臓器の虚血後の組織の損傷は、同じ炎症性のメカニズムを含むことを前提としていますので、説明したモデルが街に使用することができこのような心筋梗塞、脳卒中または腸管虚血などの条件に該当するIRIの病態生理学的メカニズムにnの原理の洞察。 <p class="jove_s...

<table border="1"><tbody><tr><td> 機器の名前： </td><td> 会社名： </td><td> カタログ番号： </td><td> コメント： </td></tr><tr><td> Forene 100％（V / V） </td><td>アボット</td><td> B506 </td><td>イソフルランAPI </td></tr><tr><td> Terylene縫合</td><td> Serag Weissner </td><td> OC108000 </td><td></td></tr><tr><td> Portexファインボアポリエチレンチューブ</td><td>医療スミス</td><td> 800/100/100 </td><td> 0.28ミリメートル、内径</td></tr><tr><td> 0.9％食塩水</td><td> Fresinusカービ</td><td> 808771 </td><td></td></tr><tr><td>チェンジ·先端デラックス焼灼キット</td><td> Bovie医療</td><td> DEL1 </td><td></td></tr><tr><td> Abbocath-T 14G </td><td> Venisystems </td><td> G713- A01 </td><td>鏡筒として使用</td></tr><tr><td>サーボ人工呼吸器900C </td><td> Maquet </td><td></td><td>動物ventialtorとして使用</td></tr><tr><td>論理的な圧力トランスデューサー</td><td>医療スミス</td><td> MX1960 </td><td></td></tr><tr><td> Sirecust 404モニタ</td><td>ジーメンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td> ABL 700ベンチトップ·アナライザ</td><td>放射計</td><td></td><td>血液ガス測定用</td></tr><tr><td>加温パッド</td><td> Effenberger </td><td> 8319 </td><td></td></tr><tr><td>アルミステージ</td><td> Alfun </td><td> AW7022 </td><td></td></tr><tr><td>手術用顕微鏡OPMI 6 SDFC </td><td>カールツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微楽器ラボのら</td><td> S＆T </td><td> 767 </td><td></td></tr><tr><td> Biemer血管クリップ</td><td>ディーナー</td><td> 64.562 </td><td></td></tr><tr><td>鉗子を適用する</td><td>ディーナー</td><td> 64.568 </td><td> Biemer容器クリップの</td></tr><tr><td>ローダミン6G </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> R4127 </td><td></td></tr><tr><td>ワセリン白DAB </td><td>ウィンスロップ</td><td> 2726853 </td><td></td></tr><tr><td>メガネをカバー</td><td></td><td></td><td> 32×32ミリメートル</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 生体内のセットアップ </td></tr><tr><td>ツァイスAxioはスコープ1 MAT </td><td>カールツァイス</td><td> 490036 </td><td>落射蛍光顕微鏡</td></tr><tr><td> 470nmのLEDが</td><td>カールツァイス</td><td> 423052 </td><td>蛍光光源</td></tr><tr><td>コリブリ2システム</td><td>カールツァイス</td><td> 423052 </td><td></td></tr><tr><td> Wプラン·アポクロマート20倍/ 1,0 DIC </td><td>カールツァイス</td><td> 421452 </td><td>水浸対物レンズ</td></tr><tr><td> AxioCam MRM牧師3つのFireWire </td><td>カールツァイス</td><td> 426509 </td><td>高解像度デジタルカメラ</td></tr><tr><td>アクシオビジョンLEソフトウェア</td><td>カールツァイス</td><td> 410130 </td><td>オフライン解析に使用</td></tr></tbody></table>

ラットの精巣挙筋の虚血再灌流障害における白血球 - 内皮相互作用のリアルタイムデジタルイメージング（iri）

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury (IRI) of the Rat Cremaster Muscle

虚血再灌流障害（IRI）は、このような脳卒中、心筋梗塞、腸管虚血などの移植や心臓血管手術後などの病的状態の大きな配列に関与しています。以前は虚血組織の1再灌流、不可逆的な予防のために不可欠ながら、組織損傷は、罹患組織の過度の炎症を誘発する。活性酸素種の産生、補体系の活性化と増加した血管透過性に隣接し、白血球の活性化は、再灌流時の炎症性組織損傷の病理学的カスケードの原則俳優の一人です。2、3、白血球の活性化は成る多段階のプロセスです。ローリング、強固な接着と輪廻のような補因子、ケモカイン、または血小板活性化因子としての化学誘引物質に応答して、接着分子との間の複雑な相互作用によって媒介される。4 &lt;Pクラスは= &quot;jove_content&quot;&gt;毛細血管細静脈における白血球のローリングは、主に彼らのカウンターリガンドとセレクチン5の相互作用によって媒介されていますが、内皮への白血球の強固な接着は細胞間接着分子（ICAM）、血管の細胞への結合を介してセレクチン制御です。接着分子（VCAM）。6、7 白血球-内皮相互作用の in vivo観察のためのゴールドスタンダードは、1968年に記載され生体内顕微鏡の技術である8。 IRI（虚血再灌流障害）の様々なモデルが様々な器官のために記載されているものの、9月12日わずか数は、画像品質の高いレベルでの微小血管床における白血球動員の直接可視化に適しています。8 ここでは精巣挙筋微小循環の後毛細血管細静脈のデジタル生体蛍光顕微鏡を促進するラット13の定性的かつ定量的に横紋筋組織中のIRI-研究のための白血球動員を分析し、技術を達成するための詳細なマニュアルを提供する便利な方法として。我々はさらに一般的な落とし穴を説明し、読者が本当に感謝することができ、かつ安全にする方法を実行する必要があり有用なヒントを提供しています。 ステップのプロトコル·バイ·ステップでは、より長い期間の動物はしっかりと麻酔を維持するのに十分な監視の下で呼吸制御された麻酔の使用を開始する方法を表しています。その後、卓越した光学分割のための薄い平らなシートとして挙準備を説明し、よく私たちの研究室で確立されているIRIで白血球イメージングのためのプロトコルを提供しています。

精巣挙筋微小循環における毛細血管細静脈のデジタル生体蛍光顕微鏡では、白血球 - 内皮相互作用への洞察を得るために便利な方法です。<emin vivoでの&gt;</em&gt;横紋筋組織の虚血再灌流障害（IRI）であった。ここでは、安全技術を実行し、その応用と限界を議論するための詳細なプロトコルを提供しています。

ラットの精巣挙筋の虚血再灌流障害における白血球 - 内皮相互作用のリアルタイムデジタルイメージング（IRI）

虚血再灌流傷害（IRI）は、脳卒中や心筋梗塞など、広範な病理学的状態に関与している。

CRE（脛骨格筋）の微小循環の生体内顕微鏡観察は、横紋筋組織の虚血および再灌流傷害に関する知見を得るための簡便な手法です。本ステップバイステップのプロトコルでは、動脈カニューレーションによる十分なモニタリングを行いながら、動物を長時間にわたり深く麻酔状態に維持するための、呼吸制御下麻酔の開始方法について説明します。また、頸静脈のカニューレーション方法を示し、その後、優れた光学分解能を得るためにCRE matricを薄い平坦なシート状に準備する方法について記述します。当研究室で確立された、虚血再灌流障害における白血球イメージングのプロトコルを紹介します。このモデルは、虚血再灌流障害における酸化ストレス作用の解析に使用できます。虚血再灌流傷害は、心筋梗塞や腸管虚血、ならびに移植手術や心血管手術後の経過など、広範な病理学的状態で関与しています。以前に虚血状態にあった組織への再灌流は、不可逆的な組織損傷を防ぐために不可欠である一方、活性酸素種の生成、補体系の活性化、および微小血管透過性の亢進に伴い、罹患組織に過剰な炎症を誘発します。白血球の活性化は、再灌流時における炎症性組織損傷の病理学的カスケードにおける主要な要因の一つです。本稿では、虚血再灌流障害における白血球の活性化を解析するための簡便な手法として、後毛細血管静脈の生体内顕微鏡観察を推奨します。さらに、一般的な落とし穴を例示し、読者が本手法を正しく理解し、安全に実施できるようにするための有用なヒントを提供します。倫理委員会の承認を得た後、体重120〜180 gの雄のラットを麻酔し、プレキシグラス製のボックス内に配置して、イソフルラン気化器を介して2〜3 vol%のイソフルランを投与しました。適切な麻酔レベルに達した直後に、ラットの体重を測定し、頸部腹側を除毛します。体温を37 °Cに維持するため、ラットを加熱パッドの上に背臥位で配置し、シリコンマスクを用いて2 volume %のisofluraneを投与します。以下の準備は、手術用顕微鏡を使用して行うのが最適です。SRAの胸切痕付近で、2 cmの水平方向の皮膚切開を行います。唾液腺を外側に寄せます。これで頸部の腹側筋群が露出します。正中線に沿って慎重に分離し、気管を確認します。気管を1〜2 cm露出させ、マイクロ鉗子を下から挿入して挙上させます。次に、気管腹側のほぼ中央に14ゲージのチューブを気管チューブとして気管下部に挿入します。このチューブは、あらかじめ動物用人工呼吸器に接続しておいてください。その後、呼吸は1分間に35～45回の頻度で容量制御します。頸動脈カニュレーションには、1回換気量を4.5～5 mL、イソフルラン濃度を1.5～2 volume %に設定します。右胸骨舌骨筋を鈍的剥離により分離します。頸動脈を特定するため、迷走神経を頸動脈から慎重に分離し、心臓からの血流を止めるために頸動脈をAnkiマイクロ鉗子で固定します。心臓からの位置関係に基づき、頸動脈の下に2本の結紮糸を配置し、遠位側の結紮糸はきつく結び、近位側の結紮糸は緩く結びます。2本目の近位側結紮糸を配置することで、マイクロ鋏を用いて2つの結紮部位の間で頸動脈に小さな切開を加えた後、マイクロ鉗子を外した際の出血を防ぐことができます。圧トランスデューサーに接続され、生理食塩水で満たされたポリエチレンカテーテルを挿入します。マイクロ鉗子を取り除き、カテーテルをさらに動脈内へ挿入します。血液ガス分析装置を用いて断続的な動脈血ガス分析を行い、蛍光色素やその他の目的薬を静脈内投与する際は、血液のpHを生理学的範囲内に維持します。手術用顕微鏡で左頸静脈の領域に焦点を合わせ、両手に鉗子を持って薄い筋膜を裂き、頸静脈を露出させます。血流を止めるため、血管を角度付きマイクロ鉗子で固定します。鉗子を用いて、頸動脈のカニュレーションと同様の手順で、等長に切った2本の結紮糸を頸静脈の下に通します。頸静脈に小さな切開を加え、セルライン溶液でフラッシュ済みのポリエチレンカテーテルを挿入します。カテーテルを心臓方向へ進め、心臓に近い側の結紮糸を締め付けます。静脈およびカテーテルの周囲に、加熱パッドの目的温度に速やかに到達するアルミ製のステージ4精索イメージングを使用します。まず、陰嚢の最遠端上の皮膚および外精索筋膜を切開し、続いて細い鋏を用いて皮下組織を慎重に剥離します。組織が露出次第、あらかじめ加温した生理食塩水で湿らせます。外精膜と陰嚢挙筋の間の結合組織を慎重に除去し、周囲の組織から挙筋を遊離させます。解剖中の持続的な灌流により組織が水和され、視認性と除去が容易になります。例えば、陰嚢の腹側遠位端にある陰嚢挙筋の末端を固定してわずかに伸展させ、切開線を近位方向に延長します。マイクロシザーを用いて、切開線に沿った出血血管を慎重に結紮します。サーマルコーリを使用し、開いた精索挙筋をアルミニウム製の台座上に平らに置きます。このとき、精巣の下にある精上皮（EPIs）には、細い靭帯、小さな動脈および静脈がまだ接続しています。電気凝固器を用いて血管を封鎖し、円盤状組織と挙筋組織の間の結合靭帯を切断します。単離した精巣を鼠径管へそっと押し戻します。組織を4か所で縫合して固定する最初の固定に加えて、糸を慎重に広げながら、精索筋組織をアルミステージ上に放射状に広げます。灌流セットアップのため、ポリエチレンカテーテルの両端を精索筋組織の近くに配置します。シリンジを使用して精索筋の周囲に petroleum gili のラインを引き、流体チャンバーを作成します。正方形のカバーガラスを組織の上に置き、縁をワセリンのラインにしっかりと密着させます。これで精索組織の顕微鏡イメージングの準備が完了しました。基本的な生体内（イントラバイタル）セットアップは異なる場合があります。EPラミネーションには、470 nanometerのLED光源を備えた生体内エピ蛍光顕微鏡を使用します。水浸対物レンズを用い、高解像度デジタルカメラによって約800 xの倍率で観察記録を行います。エピ蛍光イメージングを行う際は、実験を暗室で実施してください。白血球の標識を行うため、ルミネックス（rhumine six J）を頸静脈カテーテルから体重1kgあたり0.4mgの濃度で静脈内注射します。観察には毛細血管後静脈を選択してください。血管径は20〜60µmの範囲で、血流が十分である必要があります。虚血が起こる前に、組織を30分間安定させます。その後、白血球のローリングおよび接着の基線値を設定するために、30秒間の記録を行います。アプリケーション鉗子を用いて、露出した精索組織の極めて近位端にBemer血管クリップをそっと装着します。虚血から30分後に血管クランプを取り除きます。その後、再灌流期間を通じて記録を行うことができます。白血球ローリングを定量化するために、すべての記録で一貫した、血管を垂直に横切る仮想線を定義します。30秒間にラインを通過するローリング白血球の数を手動でカウントします。接着白血球を定量する場合、すべての記録において一貫した200 µmの血管セクションを定義してください。30秒間静止した状態で明確に視認できる白血球の数を数えます。代表的な結果は、記述プロトコルの中に記載されています。虚血再灌流傷害はさまざまな器官系で関与していることが知られていますが、ここでは骨格筋組織の再灌流傷害における白血球と内皮細胞の相互作用を分析する方法について説明します。したがって、他の臓器の虚血後組織損傷においても同様の炎症メカニズムが関与していると考えられるため、特に遊離組織移植術において重要です。本手法を用いることで、虚血再灌流障害における病理学的メカニズムに関する原理的な知見を得ることができます。精管挙筋への虚血負荷は容易に実施でき、遊離皮弁移植術などの臨床的に重要な条件を完全に反映させることが可能です。さらに、冷虚血や温虚血などの処置、あるいは炎症に影響を与える物質による染色的な灌流などの修飾を容易に適用できます。記録の数時間前または数日前に治療が必要な場合は、口腔内注入が最適な方法となります。

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Medicine

医学

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学ぶラットの精巣挙筋における虚血再灌流障害のリアルタイムイメージング手法。白血球と血管内皮細胞の相互作用を可視化し、炎症反応のメカニズム解明に役立つ実験プロトコルを詳しく解説します。

ラットの精巣挙筋の虚血再灌流障害における白血球 - 内皮相互作用のリアルタイムデジタルイメージング（IRI）

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