Name: Der schnellere, Hohe Auflösung, MTPA-GFP-basierte Mitochondriale Fusion Assay Acquiring Kinetische Daten mehrerer Zellen parallel mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Lernen Sie eine automatisierte Methode zur Messung mitochondrialer Fusion in mehreren Zellen parallel mittels photoaktivierbarem GFP und konfokaler Mikroskopie. Diese Technik liefert hochaufgelöste Daten schneller als herkömmliche Verfahren.

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Wir danken der Tufts Center for Neuroscience Research, P30 NS047243 (Jackson), die Mitochondrien Affinity Forschung Sonderforschungsbereich (mtARC) durch die Evans Zentrum für interdisziplinäre biomedizinische Forschung an der Boston University Medical Campus, Link Medicine Corporation unterstützt, und Zeiss für die Unterstützung dieser Arbeit.

1. Image Plate Vorbereitung <ol><li> Kultur INS1 Zellen in RPMI-Medium, enthaltend 10% fötales Rinderserum Standard, 1% Penicillin-Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 50 uM 2-Mercaptoethanol, 5 mM NaHCO 3, 2 mM HEPES, 2 mM Brenztraubensäure und 11 mM Glucose bis 80% Konfluenz. </li><li> Trypsinieren die INS1 Zellkulturen, die mit 0,05% Trypsin und Platte ihnen auf Poly-D-Lysin-beschichteten Deckglas-Boden Speicherfolien (30-40% Konfluenz). </li><li> Lassen Sie für Teller 60-80% Konfluenz (~ 2 Tage) zu erreichen und fügen mitochondrialen Matrix gezielt (COXVIII) adenoviralen PA-GFP für 24 Std. (MOI = 5). Exchange-Medien und ermöglichen Zellen für weitere 2 Tage vor der Bildgebung zu wachsen. </li><li> Am Tag der Bildgebung, fügen 7-15 nM TMRE zu den Speicherfolien und Gleichgewicht für mindestens 45 min. </li><li> Während dieser Zeit wiederum auf dem Inkubator (Stufe oberen Inkubator wurde hier verwendet) und ermöglichen das Mikroskop auf 37 ° C für etwa 1 Stunde lang äquilibrieren. Schalten Sie die 5% CO 2. </li&gt; </ol> 2. Bildparameter für die Zeiss LSM 710 konfokalen Mikroskop <ol><li> Nach dem Mikroskop hat äquilibriert, unter der Erwerb Registerkarte auf &quot;show Handwerkzeugen&quot; klicken, öffnen Sie die Imaging-up-Panel eingestellt, und wählen Sie &quot;Kanal-Modus&quot; wechseln und verfolgen jeden &quot;Frame&quot;. </li><li> Im Lichtweg-Panel, wählen und LSM-Channel-Modus. Arbeiten von der Probe nach oben Symbol, wählen Sie &quot;hinten&quot;, MBS-690 +, 488 und MBS. An der Unterseite des Panels, wählen Sie &quot;T-PMT&quot;, um die Visualisierung des Hellfeld oder DIC-Kanal zu ermöglichen. </li><li> Fertig zur Anpassung der Lichtweg-Parameter durch Einstellen des Bereichs für das GFP-Farbstoff 490-540 nm und 580-700 nm für die TMRE Farbstoff. </li><li> In der Übernahme-Modus, verwenden Sie ein 512 × 512 Pixel Scanfeld, durchschnittlich 4x, und wählen Sie einen Zoom-Faktor (die Sie behalten möchten, für die Kalibrierung konsistent). </li></ol> 3. Die Optimierung der Bildparameter <ol><li> Mit dem Plan Achromat 100x (1,4 NA) Objektiv, focuns auf Ihre Zellen mit dem Halogenlicht, nicht fluoreszierendes Licht, zum Schutz von Phototoxizität Mitochondrien. </li><li> Screen für PA-GFP exprimierenden Zellen mit einer maximal geöffneten Lochkamera und Scannen, um die Zellen, die heller grün zu finden. </li><li> Finden Sie die niedrigsten Macht der 2-Photonen-Laser benötigt, um die PA-GFP aktivieren und optimieren die Bildparameter sicherzustellen, dass das Signal nicht in die Sättigung des Detektors. Sicherstellen, dass die PA-GFP-Signal mit dem TMRE Signal für ein paar Z-Serie kolokalisiert. Der Verlust des TMRE Signal zeigt an mitochondrialen Depolarisation oder Phototoxizität, und Zellen, die eine diese Eigenschaften sollten nicht für die Analyse verwendet werden. </li><li> Finden Sie eine PA-GFP exprimierenden Zelle und geben Sie einen Zoom-Faktor. </li><li> Stellen Sie die Z-Serie Bereich bis 6 Scheiben (dieser Bereich benötigen, um alle 10 Zellen zu befriedigen, wenn ein eigenes z-Fokus an jeder Position gesetzt ist) zu sammeln. </li><li> Speichern der Bildgebungsverfahren für jede Zelle (Zelle 1, Zelle 2 usw.). </li></ol> 4. Passen Sie die Automated Teil des Programms und benennt die 10 Zellen, die Sie für die 1 Stunde Mitochondriale Fusion Assay folgen wird <ol><li> Auf der linken Seite des MultiTime Wählen Sie im Fenster &quot;Speichern&quot;-Panel, und geben Sie den Ort, wo Dateien gespeichert werden sollen. </li><li> In der &quot;Übernahme&quot;-Panel, laden Sie die Erwerbsmethode für Zelle 1 in der Scan-Konfiguration gespeichert und überprüfen Sie die Z-Stapel-Box. Auch die Option &quot;gekennzeichneten Z-Mitte z-Stapel&quot;. </li><li> In der &quot;Blöcke&quot; Systemsteuerung, wählen Sie &quot;Single Block an jedem Standort&quot;. Klicken Sie auf &quot;Add Blöcke&quot; für jedes Intervall gemessen werden soll. </li><li> In der &quot;Timing&quot;-Panel, wählen Sie &quot;warten Intervall&quot; und geben Sie &quot;0&quot; in der &quot;Wartezeit einhalten, bevor er auf den ersten Block Lage nur.&quot; Die Blöcke 2-4 wird &quot;15 Minuten&quot; in diesem Abschnitt. </li><li> In der Lage-Panel, wählen Sie &quot;Verschieben des Fokus auf Position zwischen den Standorten zu laden&quot; und &quot;Last Config oder zu scannen, wenn Sie auf &#39;Weiter loc&#39; geklickt &#39;to loc bewegen&quot;. Unter dem &quot;edit Standorten Liste&quot; wählen Sie &quot;Alle löschen&quot; und wählen Sie dann &quot;multiple Standorten Motortisch &quot;. </li><li> UndER der &quot;Bleach&quot;-Panel, klicken Sie auf die &quot;Bleiche&quot; ein, und benennen Sie die Konfigurationsdatei in der &quot;config&quot; im Pulldown-Menü, wie in dem Fenster der Haupt-Software bezeichnet. Dann, in der &quot;Bleichen&quot; Fenster, speichern Sie die entsprechende Methode Photoaktivierung. In den Regionen Panel, wählen Sie den ROI für diese spezielle Zelle, und stell &#39;das ROI der MultiTime durch Auswahl von &quot;Add die Region auf die ROI-Liste&quot;-Fenster. Achten Sie darauf, um die gleiche Stelle in der &quot;ROI&quot; wählen Sie im Pulldown-Menü. </li></ol> Für das Timing richtig funktioniert und für jede Zelle, um eine 15 Minuten-Intervall haben, müssen zwei Methoden, um gerettet zu werden. In der Liste der Blöcke, wird der erste, der die &quot;echte&quot; Photoaktivierung Konfiguration, und der Rest wird eine &quot;Mock&quot;-Konfiguration, die nicht nutzt die Zwei-Photonen-Laser haben. Der erste Block wird auch der einzige Block, der nicht über eine Verzögerung (BKIntv = 0) sein. Daher beginnt das Verfahren mit einer Baseline-Scan, mit einem Photoaktivierung Scan folgt. Der Rest der Blöcke haben eine 900 sec BkIntv, undzu jedem Zeitpunkt gibt es zwei Scans wie zum Zeitpunkt 0 s, um das Timing Konsistenz zu erhalten. <ol start="7"><li> Für jede der 10 Zellen im Laufe der Zeit verfolgt werden, führen diese Reihenfolge: Finden Sie eine paGFP-exprimierende Zelle speichern ihre bildgebenden Verfahren Location-Panel markieren die Position der Bühne, geben bildgebende Verfahren Haupt-ROI-Panel wählen Sie eine Region von Interesse sein photoaktivierte Bleach-Panel sparen spezifische ROI und laden Sie es auch in der ROI-Box: Löschen Sie den ROI und setzen Sie den Scan-Zoom bis 1 Finden Sie die nächste Zelle und stellen Sie den Zoom Wiederholen Sie den Vorgang für die nächsten 9 Zellen </li></ol> Überprüfen Sie, dass jede Stufe Lage und alle Blöcke die entsprechende bildgebende Verfahren (Scan-Konfiguration) zugeordnet ist. Achten Sie außerdem darauf, dass der erste Block an jedem Ort auf die entsprechende Photoaktivierung Methode entspricht, während der Rest einen &quot;Mock&quot;-Methode enthalten. Schließlich wählen Sie &quot;Ausführen&quot;. 5. Analysieren Sie die PA-GFP-Signal Intensity <ol><li&gt; Für die Zellen, in denen die photoaktivierbare-GFP-Signal kolokalisiert mit dem roten Signal TMRE, subtrahieren Sie den Hintergrund in den paGFP Bilder (hier benutzen wir Metamorph). </li><li> Dann exportieren Sie die Daten nach Excel und berechnen die durchschnittliche Intensität für Z-Stapel zu jedem Zeitpunkt. Entsorgen optische Schnitte, die kein Signal haben. </li><li> Messen Sie das Signal Verdünnung in jedem Z-Stapel durch Berechnung des Prozentsatzes der ursprünglichen photoaktivierte Signal. </li></ol> Jeder Datenpunkt abgetastet und aufgezeichnet zweimal, wodurch der doppelte Z-Stapel-Informationen für jeden Zeitpunkt. Prüfen, ob die Z-Stapel-Werte stimmen. Wenn nicht, ist dies für ein Problem (zB Fokus-, Zell-Bewegung). 6. Repräsentative Ergebnisse Wenn ein Ereignis Fusionsprotein zwischen einem aktivierten und nicht aktivierten PA-GFP Mitochondrium auftritt, mischt sich das paGFP in der mitochondrialen Matrix mit dem nicht-markierten Matrix und wird verdünnt über einen größeren Bereich, verringert das SignalIntensität (Abbildung 1A). In der Zelle INS1, tritt eine signifikante Abnahme der Signalintensität alle 15 Minuten, bis Äquilibrierung der mitochondrialen Fusion erreicht ist (etwa 1 Stunde). Beachten Sie, dass die Zelle in 1B nahezu vollständige Co-Lokalisation von PA-GFP und TMRE Signale aufweist. In diesen Tests eine sehr niedrige Konzentration von TMRE (15 nm) wird verwendet, um gezielt helfen, die Photoaktivierung von paGFP, und auch zu Zelle Gesundheit zu überwachen. Zellen mit einer Fülle von depolarisiert Mitochondrien haben unvollständige Kolokalisation von paGFP und TMRE und sollte nicht analysiert werden, da dies zeigt entweder Phototoxizität, oder Zellen in einem sterbenden Staat. Die Äquilibrierung für mitochondriale Fusion ist in der Regel für 1 Stunde in INS1 Zellen, wenn etwa 15% des mitochondrialen Volume aktiviert. Manchmal, auch wenn ein kleiner Bereich beleuchtet wird, werden die meisten Mitochondrien photoaktiviert aufgrund wobei stark vernetzt, wobei weitere Fusion ist schwer zu erkennen. Andere Zelltypen weisen unterschiedliche Zeiten für die Gleichgewichtseinstellung und sollten in kürzeren Abständen und über einen längeren Zeitraum getestet werden, um mitochondriale Dynamik zu charakterisieren. Um mitochondrialen Fusion inhibieren, können Zellen aus dem lipotoxische angeordnet zu werden. Es wurde zuvor gezeigt, dass 0,4 mM Fragmente Mitochondrien-Palmitat, und hemmt mitochondrialen Fusion 9. Dieser Effekt kann in 2, wo Mitochondrien führen gesehen werden, aber die Signalintensität des mtPAGFP nicht so viel wie unter normalen Bedingungen ändern (1). Daher ist die Verdünnung des PA-GFP-Signal dürfte darauf zurückzuführen sein, mitochondriale Fusion statt Kernspaltung. In anderen Zelltypen, empfehlen wir die Verwendung von anderen bekannten Möglichkeiten, um mitochondriale Fragmentierung induzieren, wie zum Schweigen OPA1, die für mitochondriale Fusion 14 ist. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3991/3991fig1.jpg" /> Abbildung 1. </strong&gt; Typische Verdünnung des PA-GFP-Signal nach der Photoaktivierung während eines mitochondrialen Fusion Assay. A. PA-GFP wird zunehmend dunkler durch mitochondriale Fusion Ereignisse, die zur Verdünnung des Proteins über eine zunehmende Fläche, wie in diesen projizierten Bildern zu sehen ist von 6 optische Schnitte alle 15 Minuten quantifiziert. B. TMRE mit PA-GFP zeigt, dass die Mitochondrien aktiv und nicht depolarisiert sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3991/3991fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3991/3991fig2.jpg" /> Abbildung 2. Mitochondriale Fusion mit 0,4 mM Palmitat gehemmt verringert die Verdünnung des PA-GFP. A. Projektionen von 6 optische Schnitte zeigen kurze Mitochondrien mit einer unveränderlichen Signalintensität über die Zeit. B. Kolokalisation von PA-GFP mit TMRE zeigt, dass die Mitochondrien sind nicht depolarisiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3991/3991fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> .

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Dieses Verfahren ermöglicht die Abbildung von etwa 10 Zellen zu einem Zeitpunkt, wenn die Beschaffung tritt alle 15 Minuten nach der Photoaktivierung. Die genaue Anzahl der Zellen wird davon abhängen, wie schnell man in der Lage zu lokalisieren und markieren Sie die mtPAGFP exprimierenden Zellen in der Kulturschale, und wie schnell kann man einrichten alle Software-Parameter ist. Um die Automatisierung reibungslos eine gleichmäßige Schicht von Zellen zu verwenden, weil die benannten Z-Stapel-Margen für alle Zellen anwenden wird. Die Größe dieses ersten Photoaktivierung Bereich regeln die Wartezeit. Um mitochondrialen Fusion messen, ist es wichtig, dass nur 10-20% des Netzes, so dass die Ausbreitung des Signals mit dem Rest des Netzes über die Zeit überwacht werden kann photoaktivieren. Wenn zu viel des Netzes wird photoaktiviert, ist es möglich, dass eine vollständige Fusion zu schnell kommen, und das Ereignis wird nicht erfasst werden. Äußerste Sorgfalt muss darauf geachtet werdenEinstellung der Laserleistung von der Zwei-Photonen-Laser sowie die Konzentration auf TMRE Phototoxizität die mitochondriale Depolarisation führt zu vermeiden. Sicherstellen, dass das Signal mit dem mtPAGFP TMRE Signal kolokalisiert kann bei der Beurteilung der Phototoxizität und allgemeine Gesundheit Zelle 8,15 zu helfen. Beleuchtung mit Licht epifluoerescent sollte vermieden werden. Auf der Suche nach Zellen, die mtPAGFP, sollte das Loch sein, maximal geöffneten beim Scannen mit einem Low-Power 488nm Anregung. Einstellen der Zwei-Photonen-Laser-Leistung zu photoaktivieren genug PA-GFP, um das Signal über 1 Stunde messen, aber nicht zu übersättigen eine der Zellen kann tückisch sein 8. Allerdings Mal in diesem Schritt der Optimierung ausgegeben werden sollte, denn wenn automatisiertes Programm gestartet wird, ist es mühsam, ihn zu stoppen, um mehr Zellen zu wählen, und wieder aufzunehmen. Für die Qualitätskontrolle, Akquisition eines Differential Interferenz Kontrast (DIC) Bild (oder Durchlicht), um den Fokus auf die Zellen überwachen kann sehr seinhilfreich und auch ein guter Weg, um Luftblasen im Immersionsöl während des Scannens gebildet zu erkennen; dies geschieht manchmal aus den Bewegungen der Bühne. Obwohl mit diesen Verfahren mtPAGFP sammelt Daten über die unidirektionale Bewegung der mitochondrialen Matrix Proteine ​​aus photoaktiviert Mitochondrien diejenigen, die nicht markiert sind, ist es denkbar, diese Technik auf andere Prozesse zu studieren nutzen. Zum Beispiel können bestimmte Fluorochrome, Membranproteine ​​angebracht werden, um ihre spezifischen Bewegung während der Fusion Ereignisse zu beobachten, wie es für ABC-me, die Fusion von denen auf einer anderen Zeitskala aus dem Mischen von löslichen Matrixproteine ​​15 tritt gezeigt worden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> COXIII-adenoviralen PA-GFP </td><td> Dr. Lippincott-Schwartz </td><td></td></tr><tr><td> TMRE </td><td> Invitrogen </td><td> T669 </td></tr><tr><td> Zeiss LSM 710 konfokalen </td><td> Zeiss </td><td></td></tr></tbody></table>

der schnellere, hohe auflösung, mtpa-gfp-basierte mitochondriale fusion assay acquiring kinetische daten mehrerer zellen parallel mit hilfe der konfokalen mikroskopie

A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy

Die mitochondriale Fusion spielt eine wesentliche Rolle bei der mitochondriale Calcium-Homöostase, der Bioenergetik, der Autophagie und der Qualitätskontrolle. Die Fusion wird in lebenden Zellen durch die Photo-Umwandlung eines auf die Matrix gerichteten photoaktivierbaren GFP (mtPAGFP) in einem Teil der Mitochondrien quantifiziert. Die Geschwindigkeit, mit der sich die photoumgewandelten Moleküle über die gesamte mitochondriale Population verteilen, wird als Maß für die Fusionsaktivität verwendet. Bisher wurden die Messungen mithilfe eines Einzelzell-Zeitrafferansatzes durchgeführt, bei dem die Equilibrierung in einer Zelle über eine Stunde hinweg quantifiziert wurde. Hier erweitern und automatisieren wir eine zuvor veröffentlichte Methode an lebenden Zellen, die mtPAGFP und eine geringe Konzentration von TMRE (15 nm) verwendet. Diese Methode beinhaltet die Photoaktivierung eines kleinen Bereichs des mitochondrialen Netzwerks, die Aufnahme hochauflösender Stapel konfokaler Schnitte alle 15 Minuten über einen Zeitraum von 1 Stunde sowie die Quantifizierung der Änderung der Signalmenge. Abhängig von mehreren Faktoren, wie der Leichtigkeit, Zellen mit exprimiertem PAGFP zu finden, und der Signalstärke der photoaktivierten Bereiche, ist es möglich, innerhalb der 15-Minuten-Intervalle etwa 10 Zellen zu erfassen. Dies stellt eine erhebliche Verbesserung hinsichtlich der zeitlichen Effizienz dieses Assays dar, während gleichzeitig die hochauflösende subzelluläre Quantifizierung sowie die kinetischen Parameter erhalten bleiben, die erforderlich sind, um das mitochondriale Verhalten in seiner nativen zytoarchitektonischen Umgebung detailliert abzubilden.
Die mitochondriale Dynamik spielt eine Rolle bei zahlreichen zellulären Prozessen, darunter Atmung, Kalziumregulation und Apoptose1,2,3,13. Die Struktur des mitochondrialen Netzwerks beeinflusst die Funktion der Mitochondrien sowie deren Wechselwirkung mit dem Rest der Zelle. Durch ständige Teilung und Fusion nehmen mitochondriale Netzwerke unterschiedliche Formen an, die von stark vernetzten Strukturen bis hin zu stärker fragmentierten Zuständen reichen. Interessanterweise wurden Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Chorea Huntington Typ 2A und dominante optische Atrophie mit veränderter mitochondrialer Morphologie, insbesondere fragmentierten Netzwerken, in Verbindung gebracht4,10,13. Oftmals werden Mitochondrien nach einer Fragmentierung depolarisiert, und deren Anhäufung führt zu einer beeinträchtigten Zellfunktion18. Es wurde gezeigt, dass mitochondriale Fission ein Signal für die Zelle darstellt, in die Apoptose überzugehen. Gleichzeitig kann sie einen Mechanismus darstellen, um depolarisierte und inaktive Mitochondrien abzutrennen, um den Großteil des Netzwerks funktionsfähig zu erhalten14. Die Fusion von Mitochondrien hingegen ermöglicht den Austausch von Matrixproteinen, gelösten Stoffen, mtDNA und dem elektrochemischen Gradienten und scheint außerdem den Übergang in die Apoptose zu verhindern9. Wie mitochondriale Teilung und Fusion die zelluläre Homöostase und letztlich die Funktion des Organismus beeinflussen, bedarf weiterer Aufklärung. Daher ist die kontinuierliche Entwicklung und Optimierung von Methoden zur Erfassung dieser Phänomene notwendig.
Bestehende Assays zur mitochondrialen Fusion haben verschiedene Einblicke in die mitochondriale Physiologie ermöglicht, wobei jeder seine eigenen Vorteile aufweist. Beim hybriden PEG-Fusionsassay7 werden zwei Populationen unterschiedlich markierter Zellen (mtRFP und mtYFP) gemischt und der Grad der Durchmischung sowie die Kolokalisation der Fluorophore in fusionierten, mehrkernigen Zellen analysiert. Obwohl diese Methode wertvolle Erkenntnisse geliefert hat, können nicht alle Zelltypen fusionieren, und die Bedingungen, unter denen die Fusion angeregt wird, beinhalten die Verwendung toxischer Substanzen, die den normalen Fusionsprozess wahrscheinlich beeinflussen. Kürzlich wurde eine zellfreie Technik entwickelt, bei der isolierte Mitochondrien verwendet werden, um Fusionsereignisse mittels eines Luciferase-Assays1,5 zu beobachten. Zwei humane Zelllinien werden entweder mit dem amino- oder carboxyterminalen Teil der Renilla-Luciferase sowie einem Leucin-Zipper transfiziert, um eine Dimerisierung nach dem Mischen sicherzustellen. Mitochondrien werden aus jeder Zelllinie isoliert und anschließend fusioniert. Die Fusionsreaktion kann unter physiologischen Bedingungen ohne Zytosol bei Vorhandensein von Energie, geeigneter Temperatur und intaktem membranpotenzial der inneren mitochondrialen Membran ablaufen. Interessanterweise wurde festgestellt, dass das Zytosol das Ausmaß der Fusion moduliert, was zeigt, dass zelluläre Signalwege den Fusionsprozess regulieren4,5. Dieser Assay wird sich als sehr nützlich für Hochdurchsatz-Screenings erweisen, um Komponenten der Fusionsmaschinerie sowie pharmakologische Substanzen, die die mitochondriale Dynamik beeinflussen könnten, zu identifizieren. Dennoch werden detailliertere, ganzzellbasierte mitochondriale Assays erforderlich sein, um diesen In-vitro-Assay zu ergänzen und diese Vorgänge in einem zellulären Umfeld zu beobachten.
Eine Technik zur Überwachung der Dynamik von Mitochondrien in ganzen Zellen wird bereits seit einiger Zeit angewandt und basiert auf einem mitochondrienzielgerichteten, photoaktivierbaren GFP (mtPAGFP)6,11. Nach Expression des mtPAGFP wird ein kleiner Teil des mitochondrialen Netzwerks photoaktiviert (10–20 %), und die Ausbreitung des Signals auf das restliche mitochondriale Netzwerk wird im Zeitraffer-Verfahren mittels konfokaler Mikroskopie alle 15 Minuten über eine Stunde aufgezeichnet. Jeder Fusionsevent führt zu einer Verdünnung der Signalintensität, wodurch die Fusionsrate quantifiziert werden kann. Obwohl Fusion und Fission kontinuierlich in Zellen stattfinden, erfasst diese Technik lediglich die Fusion, da die Fission keine Verdünnung des PAGFP-Signals bewirkt6. Eine gleichzeitige Markierung mit geringen Konzentrationen von TMRE (7–15 nM in INS1-Zellen) ermöglicht die Quantifizierung des Membranpotentials der Mitochondrien. Wenn Mitochondrien hyperpolarisiert sind, nehmen sie mehr TMRE auf; bei Depolarisation verlieren sie den TMRE-Farbstoff. Depolarisierte Mitochondrien weisen kein ausreichendes Membranpotential mehr auf und neigen dazu, entweder ineffizient oder gar nicht zu fusionieren. Daher können aktive, fusionierende Mitochondrien mit diesen geringen TMRE-Konzentrationen verfolgt werden9,15. Eine Anreicherung depolarisierter Mitochondrien, die kein TMRE-Signal aufweisen, kann ein Zeichen für Phototoxizität oder Zelltod sein. Höhere Konzentrationen von TMRE machen Mitochondrien sehr empfindlich gegenüber Laserlicht, weshalb sorgfältig darauf geachtet werden muss, eine Übermarkierung mit TMRE zu vermeiden. Falls der Effekt der mitochondrialen Depolarisation im Fokus steht, kann eine Technik mit leicht erhöhten TMRE-Konzentrationen und intensiverem Laserlicht verwendet werden, um Mitochondrien kontrolliert zu depolarisieren (Mitra und Lippincott-Schwartz, 2010). Um sicherzustellen, dass eine Toxizität durch TMRE keine Rolle spielt, empfehlen wir, beladene Zellen (3–15 nM TMRE) den Bildgebungsparametern auszusetzen, die im Assay verwendet werden sollen (möglicherweise 7 Stapel mit jeweils 6 optischen Schnitten hintereinander), und zwei Stunden später den Zellzustand zu beurteilen. Falls die Mitochondrien zu fragmentiert erscheinen und die Zellen absterben, könnten alternativ andere mitochondriale Marker wie dsRED oder Mitotracker red anstelle von TMRE verwendet werden.
Die mtPAGFP-Methode hat Einzelheiten über das Verhalten des mitochondrialen Netzwerks offenbart, die mit anderen Methoden nicht sichtbar gemacht werden konnten. Beispielsweise wissen wir nun, dass mitochondriale Fusion vollständig oder vorübergehend sein kann, wobei sich die Matrixinhalte vermischen können, ohne dass sich die Gesamtmorphologie des Netzwerks verändert. Außerdem wissen wir, dass die Wahrscheinlichkeit einer Fusion unabhängig von der Dauer des Kontakts und den Organelldimensionen ist, jedoch von der Organelle-Beweglichkeit, dem Membranpotenzial und der Vorgeschichte früherer Fusionsaktivitäten beeinflusst wird8,15,16,17.
In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methodik zur Hochskalierung des zuvor veröffentlichten Protokolls unter Verwendung von mtPAGFP und 15 nM TMRE8, um mehrere Zellen gleichzeitig zu untersuchen und die zeitliche Effizienz der Datenerfassung zu verbessern, ohne die subzelluläre Auflösung zu beeinträchtigen. Dies wurde durch den Einsatz eines automatisierten Mikroskopstages und programmierbarer Bildaufnahmesoftware ermöglicht. Die Zen-Software von Zeiss erlaubt es dem Anwender, mehrere definierte Zellen, die mtPAGFP exprimieren, zu markieren und zu verfolgen. Jede dieser Zellen kann in einem bestimmten Interessenbereich photoaktiviert werden, und Stapel von konfokalen Schnittbildern können in festgelegten Zeitabständen sowohl für das mtPAGFP-Signal als auch für TMRE überwacht werden. Andere konfokale Systeme könnten verwendet werden, um dieses Protokoll durchzuführen, vorausgesetzt, sie verfügen über einen programmierbaren automatisierten Stage, einen Inkubator mit CO2 und eine Möglichkeit zur Photoaktivierung des PAGFP – entweder mittels Multiphotonenlaser oder eines 405-nm-Diodenlasers.

Mitochondrien-Fusion wurde durch das Verfolgen der Äquilibrierung von photokonvertiertem Matrix-bezogenen GFP über die mitochondriale Netzes über die Zeit gemessen. Bisher konnte nur eine Zelle zu einer Stunde lange kinetische Analyse bei einer Zeit unterworfen werden. Wir präsentieren eine Methode, die misst gleichzeitig mehrere Zellen und beschleunigt so den Prozess der Datensammlung.

Der schnellere, Hohe Auflösung, MTPA-GFP-basierte Mitochondriale Fusion Assay Acquiring Kinetische Daten mehrerer Zellen parallel mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie

Die mitochondriale Fusion spielt eine wesentliche Rolle bei der mitochondrialen Calcium-Homöostase, der Bioenergetik, der Autophagie und der Qualitätskontrolle. Die Fusion wird in ... quantifiziert.

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die mitochondriale Fusion in hochaufgelösten 3D-Bildern mehrerer Zellen parallel zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein mitochondriales, photoaktivierbares GFP in den Zellen von Interesse exprimiert wird. Anschließend wird das GFP in einem kleinen Bereich der mitochondrialen Population in jeder Zelle photoaktiviert.Dann werden alle 15 Minuten sechs optische Schnitte jeder Zelle aufgenommen, bis die Signalverteilung im Gleichgewicht ist, um das Ausmaß der mitochondrialen Fusion zu bewerten. Letztendlich kann anhand der Quantifizierung des fluoreszierenden Signals die Verdünnung der mitochondrienspezifisch markierten photoaktivierbaren GFP-Intensität in Zellen, die eine mitochondriale Fusion durchlaufen, bestimmt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie automatisiert ist und daher hochauflösende Daten von mehreren Zellen schneller erfasst werden können. Obwohl diese Methode an INS-1-Zellen demonstriert wird und Erkenntnisse zur Diabetesforschung liefert, kann sie auch auf andere Zelltypen angewendet werden, um die mitochondriale Fusion im Alter sowie bei Stoffwechsel- und neurodegenerativen Erkrankungen zu untersuchen.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte zur Bildautomatisierung an anderer Stelle nicht beschrieben sind. Nachdem die INS-eine-Zellen bis zu einer Konfluenz von 80 % kultiviert wurden, lösen Sie die Kulturen mit 0,05 % Trypsin ab und impfen die resuspendierten Zellen auf Deckglas-Boden-Bildgebungsplatten, die zuvor mit Poly-D-Lysin beschichtet wurden. Nach zwei Tagen Kultivierung fügen Sie adenovirales, auf die mitochondriale Matrix gerichtetes, photoaktivierbares GFP den Platten hinzu.Danach die Zellen 24 Stunden lang kultivieren, das Medium wechseln und die Zellen weitere zwei Tage wachsen lassen. Am Tag der Bildgebung 7 bis 15 Nanomolar TMRE zu den Bildgebungsplatten hinzufügen und die Kulturen mindestens 45 Minuten lang äquilibratisieren. Während dieser Zeit das 5 %igen Kohlendioxid, den Inkubator und das Mikroskop einschalten, nachdem das Mikroskop äquilibriert hat.Unter der Registerkarte „Acquisition“ auf „Manuelle Werkzeuge anzeigen“ klicken. Das Aufnahmeeinstellungsfenster öffnen und dann den Kanalmodus auswählen und wechseln. Jeden Frame im Lichtwegfenster verfolgen.Wählen Sie LSM und den Kanalmodus aus. Wählen Sie dann im Probensymbol, beginnend von unten, „Rear MBS six 90 plus“ und „MBS 4 88“ am unteren Rand des Bedienfelds aus und aktivieren Sie TPMT, um die Hellfeld- oder DIC-Kanäle sichtbar zu machen. Schließen Sie die Anpassung der Lichtpfadparameter ab, indem Sie den Bereich für den GFP-Farbstoff auf 490 bis 540 Nanometer und für den TMRE-Farbstoff auf 580 bis 700 Nanometer einstellen.Öffnen Sie abschließend den Akquisitionsmodus und stellen Sie ein Scanfeld von 512 mal 512 Pixeln in der Bildgröße sowie einen Durchschnitt von vier x im Menü für die Anzahl der Mittelungen ein. Fokussieren Sie nun mithilfe eines Objektivs die Zellen mit Halogenlicht. Öffnen Sie die Blende auf das Maximum und scannen Sie, um die hellgrün leuchtenden photoaktivierbaren GFP-exprimierenden Zellen zu finden.Wählen Sie ein beliebiges Laserleistungs-Foto aus, aktivieren Sie die Zelle und nehmen Sie dann eine Z-Serie optischer Schnitte durch die Zelle auf, um zu überprüfen, ob die Aktivierung ausreichend ist. Danach stellen Sie den 488-Nanometer-Bildgebungs-Laser auf eine niedrige Leistung ein, ohne den Detektorverstärkungsfaktor vollständig zu maximieren, um ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis beizubehalten. Nachdem sichergestellt ist, dass das Signal nicht gesättigt ist, bestätigen Sie, dass das photoaktivierbare GFP-Signal mit dem TMRE-Signal ko-lokalisiert ist.Öffnen Sie abschließend die Lochblende, erhöhen Sie den Verstärkungsfaktor am Detektor und suchen Sie eine neue photoaktivierbare Zelle, die GFP exprimiert; legen Sie anschließend den Zoomfaktor fest. Stellen Sie dann den Z-Serienbereich so ein, dass sechs Schichten aufgenommen werden, und speichern Sie die Bildgebungsmethode. Öffnen Sie nun das Multizeitfenster im linken Bereich.Wählen Sie das Speicherpanel aus und klicken Sie auf „Bilderordner auswählen“, um den Speicherort für die Dateien festzulegen. Wählen Sie anschließend im Erfassungspanel die soeben gespeicherte Bildgebungsmethode im Dropdown-Menü „Scan-Konfiguration“. Danach wählen Sie den markierten Z-Mittelpunkt des Z-Stapels aus.Öffnen Sie nun das Blockfeld und wählen Sie an jeder Position einen einzelnen Block aus. Klicken Sie dann für jedes zu messende Intervall auf „Blöcke hinzufügen“, öffnen Sie das Zeitfeld, wählen Sie „Gewichtungsintervall“ und geben Sie anschließend nur in das Feld „Gewichtungsintervall vor Block an erster Position“ eine Null ein. Nachdem Sie das Ortsfeld ausgewählt haben, wählen Sie „Fokus auf Lastposition zwischen Orten verschieben“ und „Scan-Konfiguration beim Klicken auf LO oder nächstes LO laden“ unter der Liste „Orte bearbeiten“, wählen Sie „Alles löschen“ und anschließend „Mehrere Orte motorisierter Tisch“ unter dem Bleichfeld, aktivieren Sie das Kontrollkästchen „Bleichen“ und legen Sie die Konfigurationsdatei im Dropdown-Menü „Konfiguration“ fest.Danach im Bleich-Fenster der Hauptsoftware die geeignete Photoaktivierungsmethode im Bereichsfenster speichern. Wählen Sie die ROI für diese bestimmte Zelle aus und fügen Sie diese ROI zur Mehrfachzeit hinzu, indem Sie im Fenster „aktuelle Region zur ROI-Liste hinzufügen“ die Option „hinzufügen“ wählen. Stellen Sie sicher, dass Sie im Dropdown-Menü für die ROI denselben Ort auswählen.Schließlich führen Sie für jede der 10 Zellen, die über die Zeit verfolgt werden sollen, die folgende Abfolge durch. Zunächst geben Sie beim Auffinden einer Zelle ihre Position auf dem Objekttisch im Positionsbedienfeld an und legen ihre spezifische Scan-Konfigurationsmethode im Erfassungsbedienfeld fest. Stellen Sie sicher, dass die Scan-Konfiguration für alle Blöcke angegeben wird.Danach im Hauptbereichsfenster den interessierenden Bereich auswählen, der fotostimuliert werden soll. Anschließend im Bleich-Fenster die ROI speichern und im ROI-Fenster laden. Danach die ROI im Hauptbereichsfenster löschen und den Scan zurücksetzen.Heranzoomen auf eine Zelle, schließlich die nächste Zelle finden und den Zoom einstellen. Nach Wiederholung des Vorgangs für die nächsten neun Zellen überprüfen, ob jeder Objektträgerplatz und alle Blöcke die entsprechende Scan-Konfiguration aufweisen, und ob der erste Block an jeder Position der geeigneten Photoaktivierungsmethode entspricht, während die übrigen eine Mock-Methode enthalten. Anschließend „Ausführen“ für die Zellen auswählen, bei denen das photoaktivierte GFP-Signal überwiegend mit dem roten TMRE-Signal koliokalisiert.Subtrahieren Sie den Hintergrund in den fotoaktivierten GFP-Bildern und konfigurieren Sie anschließend die Bereichsmessungen so, dass sie die durchschnittliche Intensität wiedergeben. Exportieren Sie dann die Daten für jede Schicht des ZS-Stapels in eine Excel-Datei. Nachdem Sie die Ebenen ohne Signal ausgeschlossen haben, dividieren Sie die Intensität des ZS-Stapels jedes Zeitpunkts durch die anfängliche fotoaktivierte Intensität und ermitteln Sie den Prozentsatz des ursprünglichen Signals in der INS-einen Zelle.Alle 15 Minuten über eine Stunde hinweg tritt eine signifikante Abnahme der Signalintensität auf, bis die Gleichgewichtseinstellung der mitochondrialen Fusion erreicht ist. Wie in diesen projizierten Bildern von sechs optischen Schnitten gezeigt, die während eines typischen mitochondrialen Fusionsassays alle 15 Minuten quantifiziert wurden. In diesen Assays wird eine sehr geringe Konzentration von TMRE verwendet, um die Photoaktivierung von GFP gezielt zu unterstützen und die Zellgesundheit zu überwachen.Beachten Sie, dass die Zelle eine nahezu vollständige Kolokalisation des photoaktivierbaren GFP in Grün und der TMRE-Signale in Rot aufweist und dass die Kofärbung der Farbstoffe zeigt, dass die Mitochondrien aktiv sind und bei niedrigen Millimolar-Konzentrationen nicht depolarisiert wurden. Palmitat fragmentiert Mitochondrien und hemmt die mitochondriale Fusion. Wie in diesen optischen Schnitten einer mit Palmitat behandelten Zelle zu sehen ist, sind die Mitochondrien daher fragmentiert, und die Signalintensität des im Matrixraum lokalisierten photoaktivierbaren GFP änderte sich nicht so stark wie unter normalen Bedingungen, wie in der vorherigen Abbildung gezeigt. Daher ist die Verdünnung des photoaktivierten GFP-Signals, die in dieser Abbildung zu sehen ist, wahrscheinlich auf mitochondriale Fusion und nicht auf Fission zurückzuführen. Bei der Einrichtung dieser Methode sollte man darauf achten, Zellen auszuwählen, in denen GFP und TMRE kolokalisieren, um genügend GFP zu photoaktivieren, sodass ein nachweisbares Signal erhalten bleibt, aber nicht so viel, dass mitochondriale Fusionereignisse übersehen werden, und sicherzustellen, dass das gesamte mitochondriale Volumen innerhalb der optischen Schichten erfasst wird, um zu bestimmen, was mit den mitochondrialen Netzwerken geschieht. Um zu untersuchen, wie mitochondriale Netzwerke in Abwesenheit bestimmter regulatorischer Proteine oder Signalmoleküle reagieren, kann dieser Assay in mehreren experimentellen Gruppen durchgeführt werden, in denen Gene stillgelegt oder die Zellen mit verschiedenen Wirkstoffen behandelt werden. Die Möglichkeit, mitochondriale Fusion zu quantifizieren und Parameter statistisch zu analysieren, ermöglicht die Untersuchung der mitochondrialen Dynamik in Krankheitszuständen und trägt zur Entwicklung therapeutischer Behandlungsansätze bei.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Diese visualisiert Experiment ist ein Leitfaden für die Verwendung eines fluoreszierenden molekularen Klon des HIV für Live-konfokale Abbildung Experimente.

Visualizing Zell-Zell-Transfer von HIV unter Verwendung von fluoreszierenden Klone von HIV und Live-konfokale Mikroskopie

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Quelle: Kennedy, L. H., et. al. Visualisierung und Live-Bildgebung von Oligodendrozyten-Organellen in organotypischen Hirnschnitten mittels Adeno-assoziierter Virus- und Konfokalmikroskopie. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt die Bildgebung von Oligodendrozyten-Mitochondrien in organotypischen Schnitten des Gehirns von Mäusen. Die Scheibe wird in eine Badekammer mit kontinuierlicher Flüssigkeitszirkulation und kontrollierter Temperatur gelegt. Nach dem Einstellen verschiedener Parameter des...

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