פרוטוקול פשוט לחילוץ Hemocytes מזחלי Wild
15 בנובמבר 2012
hemocytes חרקים למלא תפקידים חשובים רבים, הוא חיסון ושאינם מחוסנים, לאורך כל שלבי התפתחות חרקים. הידע הנוכחי שלנו של הסוגים והתפקוד hemocyte מגיע ממחקרים על מודלים גנטיים של חרקים. כאן, אנו מציגים שיטה לחילוץ, כימות והמחשת hemocytes מזחלים פרא.
המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להפיק, להדגים ולספור המוציטים (hemocytes) מזחלים פראיים. דבר זה מושג תחילה על ידי הרדמת הזחל באמצעות הנחתו על קרח, הזרקת תמיסת באפר הכוללת נוגד קרישה, והחזרת הזחל לקרח כדי לאפשר להמוציטים לחזור למחזור הדם לפני ההפקה. השלב השני הוא ביצוע חתך רדוד בקצה האחורי של הזחל באמצעות סקלפל נקי.
בשלב הבא, לוחצים בעדינות על הזחל באמצעות פינצטה רכה. לאחר מכן, שואבים את תערובת תמיסת הבופר וההמולימפה באמצעות מיקרו-פיפט ומעבירים אותה למבחנת מיקרו-צנטריפוגה. השלב הסופי הוא ערבוב עדין של תמיסת ההמולימפה עם נפח שווה של תמיסת בופר, והעברה של 10 µL מהתמיסה להמוציטומטר כדי להדמיאן ולספור את מספר ההמוציטים.
בסופו של דבר, ניתן להשתמש בשיטה זו למיצוי המוציטים כדרך מהירה ואפקטיבית לספירת המוציטים ממינים שונים של זחלי פרפר, וככלי לבחינת היבטים פיזיולוגיים של התגובה החיסונית התאית של החרקים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי למצות המולימפה מזחלים בעלי פרוקסימה מקוצצת מאוד. מודלים אחרים של זחלים מנוזפים על ידי חיתוך של אחת הפרוקסימות, תוך מיצוי ההמוציטים מהנוזל שיוצא.
בנוסף, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי להפיק המולימפה ממיני חרקים אחרים. שיטה זו יכולה לשמש למתן מענה לשאלות מפתח בתחום האימונו-אקולוגיה, כגון כיצד התגובה החיסונית התאית של החרק משתנה בהתאם לאיכות התזונה, לשלב ההתפתחותי או לחשיפה לפתוגנים שונים. כדי להתחיל בהליך זה, הרדימו את הזחלים בשלב הגוזל (instar) הלפני-אחרון על ידי קירורם על קרח למשך 20 דקות לפני הפקת ההמוציטים.
לאחר מכן, הכנס את הקצה הקהה של מחט קפילרית נקייה בכיול 16 gauge לתוך הפיתול המחובר למזרק זכוכית של 20 milliliter. השאר את המבחנה המכילה את תמיסת האיסוף פתוחה על שולחן המעבדה. מלא לאט את הקפילרה בכ-10 עד 15 microliters של בופר.
לאחר מכן, הניחו את המחט על כדור חימר הממוקם לצד מיקרוסקופ הדיסקציה. מקמו את הזחל בצלחת פטרי. יש למקם את חרק על צדו כך שהספירות יהיו גלויות בבירור.
בזמן צפייה תחת מיקרוסקופ סטריאו, החזיקו את הזחֵל במקומו באמצעות פינצטה והניחו את המחט קרוב לאחד מהבליטות הכדוריות, שם הקוטיקולה של החרק רכה יותר בדרך כלל. לאחר מכן, לחצו בעדינות עם מחט הקפילרה על גוף החרק. ברגע שהמחט חדרה דרך הקוטיקולה, הזריקו את כל נפח התמיסה אל תוך הזחֵל.
גופו של הזחל יתנפח בעקבות ההזרקה, אך הוא לא אמור להתבקע או לנזול. החזירו את הזחל לפטריית הצשית המקוררת. מקמו את החרק על גבב לשם מניעת דליפת התמיכה מהפצע.
חזור על ההזרקות עבור כל זחל שמשמש להפקת המולימפה. לאחר מכן, השאר את כל החרקים לקירור על קרח למשך 30 דקות. כעת, הנח את הזחל בצלחת פטרי תחת מיקרוסקופ דיסקסיבי.
בצעו בזהירות חתך רדוד באורך של כ-שני עד שלושה מילימטרים באזור האחורי של הזחל, באמצעות סכין מנתחים סטרילית, מבלי לפגוע במעי או באיברים פנימיים אחרים. לאחר מכן, לחצו בעדינות על הזחל באמצעות פינצטה מפלסטיק גמיש תוך איסוף של כ-10 עד 20 µL של תערובת ההמולימפה באמצעות טיפ של פיפט של 10 µL. שוב, היזהרו לא לפגוע ברקמות הפנימיות.
לאחר מכן, השליכו את שאריות הזחלים. אספו את ה-hemo limp מכל זחל לשפופרות מיקרו-צנטריפוגה סיליקוניות נפרדות עם תווית, בנפח 0.5 milliliter. לאחר מכן, הוסיפו כ-10 עד 20 microliters של תמיסת האינקובציה לכל דגימת hemo limp שנאספה מזחל בודד.
שמר את דגימות ההמולימפה על קרח בכל עת בשלב זה. ערבב את דגימת ההמולימפה ואת תמיסת האינקובציה מיד לפני ספירת ה-hemocytes.
טיפול זה מאפשר הפרדה נאותה של ההמוציטים ומונע התגבשות. השתמש בקצה פיפטה נקי כדי להעביר 10 µL של דגימת המולימפה מעורבבת עם תמיסת האינקובציה אל תוך המוציטומטר. לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ קומפונד, ספור ורשום את מספר ההמוציטים בלפחות 15 מהריבועים הגדולים של הסבכה המרכזית של ההמוציטומטר.
חברו ערכים אלה כדי לקבל סכום כולל של מספר ההמוציטים ב-15 הריבועים. לאחר מכן, שטפו היטב את ההמוציטומטר ואת זכוכית הכיסוי שלו באמצעות בקבוק שטיפה עם מים מזוקקים ודה-יוניים. לאחר מכן, נגבו אותם עד לייבוש בעזרת ניירות Kim wipes.
חזור על הפרוצדורות עבור שאר דגימות ה-hemo limp וחשב את מספר ה-he cytes הממוצע למוליליטר של נפח hemo limp עבור כל זחל. תמונת מיקרוסקופיית השדה המואר מציגה את ה-he cytes שהופקו מזחלי nucle hin ai בהגדלה של 20x. בעקבות פרוצדורה זו, ניתן להשתמש ב-he cytes שנאספו כדי לחקור תגובה חיסונית תאית ולהקים בדיקות כגון פגוציטוזה, cap, select encapsulation ופעילות pH oxidase.
בנוסף, ניתן לאסוף R-N-A-D-N-A וחלבונים שלא נעשה בהם שימוש לבדיקות נוספות, וזאת על מנת לחקור תגובות חיסוניות תאיות אלו בחרקים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הזרקת זחלים לצורך הפקת המולימפה, וכן כיצד לאסוף המולימפה המכילה המוציטים חיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה למיצוי, כימות והדמיה של המוציטים מדודקים בטבע. להמוציטים תפקידים מכריעים הן בתפקודים חיסוניים והן בתפקודים שאינם חיסוניים לאורך התפתחות החרק.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה של חרקים
- תפקוד המוציטים
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- המוציטים חיוניים לתגובות החיסון של חרקים.
- הבנת סוגי ההמוציטים מסייעת בחקר הביולוגיה של חרקים.
- הידע הנוכחי מבוסס בעיקר על מודלים גנטיים.
- מחקר זה מתמקד בזחלי פרפרים ברים במטרה להרחיב את הידע הקיים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה להפקת המוציטים.
- ויזואליזציה של המוציטים להבנה טובה יותר של תפקודיהם.
- כימות של המוציטים להערכת תפקידם בפיזיולוגיה של חרקים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הרדמת זחלים על קרח.
- הזרקת תמיסת בופר עם נוגד קרישה.
- ביצוע חתך רדוד להקל על מיצוי ההמוציטים.
- שאיבת ההמולימפה וערבובה עם בופר לצורך ניתוח.
תוצאות עיקריות
- הצלחה במיצוי ובויזואליזציה של המוציטים.
- כימות של המוציטים באמצעות המוציטומטר.
- הוכחת היתכנות של השיטה בזחלים ברים.
- מתן תובנות לגבי זרימה ותפקוד של המוציטים.
מסקנות
- השיטה מאפשרת מחקר יעיל של המוציטים בזחלי פרפרים בטבע.
- משפרת את ההבנה של תגובות חיסוניות בחרקים.
- ניתנת ליישום במיני חרקים אחרים לצורך מחקרים השוואתיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיצוי וכימות מהימנים של המוציטים (hemocytes) מזחלי פרא מאפשרים את חקר מנגנוני החסינות המולדת במיני חרקים שאינם מיני מודל, ובכך תומכים בתיקוף יעדים בשלבים מוקדמים של אימונולוגיית חרקים. פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה סטנדרטית לבידוד תאי מערכת החיסון, ובכך מקל על ביצוע מחקרים השוואתיים ובדיקות תפקודיות הרלוואנטיות למחקר תרגומי ולאקו-אימונולוגיה. השיטה מגבירה את הביטחון בניבוי מאפייני התגובה החיסונית, ומספקת בסיס לקבלת החלטות מותאמות סיכון במסלולי גילוי המערבים מודלים של חרקים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשרת בחינה של מגוון ותפקוד של תאי חיסון בחרקים במינים שאינם מיני מודל.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים (biological de-risking) באמצעות מתן גישה לתאי חיסון ראשוניים למחקרים מכניסטיים.
- מאפשר תיקוף תפקודי של מטרה באמצעות בדיקות אימונולוגיות של שלבי המשך.
- משפר את הביטחון החזוי בהיפותזות של תגובה חיסונית במחקרים המבוססים על חרקים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין דגימות המוציטים מאוששות עבור בדיקות חיסוניות כמותיות ותפקודיות.
- מבצע סטנדרטיזציה של מיצוי וספירת תאים, ובכך תומך בחזרתיות בין ניסויים.
- מאפשר הכנה בקנה מידה רחב של המוציטים לצורך סריקת השפעות של פתוגנים או תרכובות.
- מספק מספר תאים מהימן לצורך נורמליזציה של הבדיקה וניתוח השוואתי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- עולה בקנה אחד עם מחקרי אקו-אימונולוגיה (eco-immunology) בכך שמאפשר ביצוע פרופיל חיסוני באוכלוסיות בר.
- תומך ברצף מהאיסוף בשטח ועד לבדיקות תפקודיות מבוססות מעבדה.
- מקל על קידום מותאם סיכון של מודלים של חרקים למחקר תרגומי.
- מספק הפחתת סיכונים מנגנונית עבור מחקרים של מודיולציה חיסונית ואינטראקציה עם פתוגנים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
פרוטוקול מיצוי ההמוציטים הזה מתאים לממשק שבין השלב המוקדם של הגילוי לפיתוח הבדיקה, ומאפשר מחקרים של תאי מערכת החיסון המונחים על ידי היפותזה במודלים של חרקים ברים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות על גיוון ותפקוד של תאי מערכת החיסון בחרקים שאינם אורגניזמי מודל.
- סריקה: מספקת תכשירי המוציטים (hemocytes) כמותיים וסטנדרטיים עבור מבחני חיסון המשכיים.
- אנליזה: מספקת ספירות תאים ונתונים מורפולוגיים להשוואת תגובות חיסוניות בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מגשר בין איסוף מהשטח לבין אפיין חיסוני במעבדה עבור מחקרי אקו-אימונולוגיה ומחקרים השוואתיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פרוטוקול הניתן לשימוש חוזר וניתן להתאמה למינים שונים של פרפרים (lepidopteran) ומיני חרקים קרובי משפחה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במחקרי תאי מערכת החיסון ומפחית עמימות מכניסטית באימונולוגיה של חרקים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של מיצוי וספירת המוציטים עבור תהליכי עבודה הניתנים לשחזור ולהרחבה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקת ניסויים (go/no-go) במחקרי חיסון מבוססי חרקים ובמסלולי עבודה של אקו-אימונולוגיה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של מודלי חרקים למחקרים פונקציונליים וטרנסלציונליים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בחרקים ובטכניקות של מיקרו-דיסקציה.
- נדרשת גישה למיקרוסקופי דיסקציה ומיקרוסקופים קומפיונדים, המוציטומטרים וכלים סטריליים.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין צוותים עבור פרוטוקולי איסוף דגימות וספירת תאים.
- ניתן להתאמה למינים שונים של פרפרים וחרקים קרובים באמצעות שינויים קלים.
- תנובת הדגימה וחיוניות התאים עשויות להשתנות בהתאם למין ולשלב ההתפתחותי.
