שיטה מעשית ורומן לחלץ הדנ"א הגנומי מערכות דם אוסף לשימור חלבון פלזמה

סרטון זה יתאר שיטה מעשית וחדשנית לחילוץ DNA גנומי ממערכת שימור חלבון פלזמה חדשה BDP 100 המכונה צינורות P 100. תנ"א. מיצוי מצינורות פלזמה נוספים בסרום היה הליך נפוץ למדי בעבר, אך השילוב של שפופרת P 100 החדשה הזו ושיטת המיצוי המוצגת כאן מציע גישה חדשה וקלה יותר לאחזור DNA באיכות טובה יותר בהרבה פחות מאמץ. החלק הפנימי של צינור P 100 מצופה במעכבי אשלגן EDTA ופרוטאז.

זה מונע קרישה ומייצב חלבוני פלזמה. דם נאסף בצינורות אלה לצורך אחזור בבדיקת פלזמה לאחר צנטריפוגה. הדם הכלול ב-P 100 יתפצל לשכבות על סמך צפיפות הפלזמה החלקית בחלק העליון, תאי הדם האדומים בחלק התחתון ותאי הדם הלבנים.

מעיל באפי בין שתי השכבות הללו. אחזור פלזמה הוא בדרך כלל השימוש העיקרי בצינורות אלה. מספר מדידות נעשות באמצעות פלזמה זו, כגון רמות נוגדנים וחלבונים.

הפרווה של באפי מושלכת בדרך כלל, אך כפי שנראה בסרטון זה, מכילה מספיק DNA למספר ניתוחים כולל ריצוף, גנוטיפ, זיהוי סמנים ביולוגיים וכן הלאה. P 100 מורכבים משלושה רכיבים עיקריים, צינור מכסה ומפריד. המפריד המכני נודד ממש מעל שכבת המעיל של באפי.

כדי לקבל גישה למעיל האפי, יש צורך להגדיל את המרחק מהמפריד למעיל האפי. זה מושג בתוספת של 17% סוכרוז. בדרך כלל משליכים את מעיל הבאפי עם ה-P 102, אך כפי שנראה בסרטון זה, ניתן לאחזר בקלות מספיק DNA משכבה זו כדי לבצע מספר בדיקות אנליטיות לפני שליפת צינורות P 100 מהמקפיא מינוס 80.

מחממים אמבט מים ל-37 מעלות צלזיוס, מכניסים כל צינור P 100 לאמבט המים החמים ודוגרים כחמש דקות כדי להפשיר את כל הדגימות. לאחר שכל הדגימות מופשרות לחלוטין, יש להסיר את כל הסרום שנותר מעל המפריד. חמשת המיליליטר הבאים של 17% סוכרוז מתווספים מעל המפריד לאחר הוספת סוכרוז, צנטריפוגה, כל הצינורות למשך 20 דקות ב-2, 500 גרם.עכשיו כשהמפריד נמצא בחלק העליון של הצינור ומשוחרר ממעיל האפי, ניתן להסיר אותו בקלות.

הוא מרסס 70% אתנול על מגבון כימי ומעקר וו מהדק על ידי ניגוב יסודי של כל המשטח. החזק את צינור P 100 בזווית של 45 מעלות עם מהדק הנייר הסטרילי. התחל להוציא את המפריד מהצינור על ידי משיכה עדינה כלפי מעלה של שפת המפריד והובלתו לתוך שקית ביולוגית.

כשהמפריד בחוץ, הסר כמה שיותר משכבת הסוכרוז של 17% מבלי להפריע למעיל הבאפי או לשכבות כדוריות הדם האדומות, מעיל הבאפי צריך להיות כעת השכבה העליונה ביותר בצינור. העבירו שכבה זו לבקבוקון חרוטי חדש של 15 מיליליטר. נפח מעיל הבאפי שהוסר עבור כל צינור ישתנה, אך צריך להיות פחות משלושה מיליליטר.

כדי לנרמל את נפח כל הצינורות, הוסף מספיק מי מלח פוספט PBS כדי להביא את נפח כל צינור לשלושה מיליליטר. כעת, כשכל פרוות באפי תלויות בנפח שווה, יש להסיר את כל תאי הדם האדומים שנותרו בתוספת של תשעה מיליליטר. תמיסת ליזה RBC של תאי דם אדומים.

לאחר מכן, הפוך צינורות מספר פעמים במהלך דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי להפריד את תאי הדם האדומים הליזה מצנטריפוגת קוד באפי למשך חמש דקות בצנטריפוגה של 2,500 גרם פנימה יוצר גלולה שממנה יופק DNA. שפכו את הפסולת הזו מכל צינור לתוך מיכל ביולוגי נוזלי, והשאירו נפח קטן שלתוכו הגלולה תושהה מחדש. מערבל את הצינור כדי לעקור ולהשעות מחדש את הגלולה.

הוסף תמיסת ליזה של תאים של שלושה מיליליטר ומערבולת במרץ למשך 10 שניות לפחות. לאחר ליזה של התאים, חלבונים ו-DNA מושעים כעת בחופשיות בתוך תמיסה ויש להפריד אותם, להתחיל בזירוז חלבונים באמצעות תמיסת משקעים של חלבון מיליליטר אחד, ו-VORTEXING oh גבוה למשך 15 שניות לפחות. כעת, צנטריפוגה את הצינורות למשך חמש דקות של 2,500 גרם כדי לגלול את החלבונים במהלך הצנטריפוגה הזו.

צעד בהתאם. סמן בקבוקון חרוטי אחד של 15 מיליליטר עבור כל דגימה המעובדת לכל צינור חדש. מעבירים שלושה מיליליטר, 100% איזופרופנול.

לאחר שהחלבונים הושקעו וצנטריפוגה, לכל צינור צריך להיות כדור גדול יחסית וקנקנט סופרנטנט שקוף בעיקר וואט, ה-DNA המכיל סופרנטנט לכל צינור לתוך צינור האיזופרופנול המתאים שהוכן במהלך הסיבוב האחרון, האיזופרופנול אמור לגרום ל-DNA בתמיסה לזרז מיתרים דקיקים לבנים קטנים להפוך את כל הצינורות 50 פעמים כדי להבטיח ערבוב טוב של הצנטריפוגה הבאה, כל הצינורות במשך שלוש דקות ב-2,500 גרם ליצירת גלולת DNA, ה-DNA נראה בדרך כלל ככדור לבן קטן בתחתית הצינור. עם זאת, תפוקת DNA נמוכה עשויה להיות בלתי נראית לעין. המשיכו עם כל העקירות עד למדידת הריכוזים.

ללא קשר לנוכחות של כדור DNA, השלך את האיזופרופנול s natin. צפו ב-DNA על ידי הוספת 70% אתנול. זה יסיר את כל הרכיבים הלא רצויים שנותרו שעלולים להפריע לצנטריפוגת ניתוח מאוחרת יותר למשך דקה אחת ב-2, 500 G.To להבטיח שכדור ה-DNA מחובר היטב לתחתית הצינור, להשליך את כל האתנול 70% מהצינורות ואז להפוך על מגבת נייר נקייה לייבוש באוויר למשך שעה.

לא אמור להישאר אתנול גלוי בצינורות בעת המשך הפרוטוקול. השלב האחרון במיצוי הוא החייאה, השעיית ה-DNA בתמיסה. תמיסת הידרציה של DNA או מים הם אפשרויות מתאימות לרוב העקירות.

הוסף תמיסת הידרציה של 250 מיקרוליטר DNA פחות עבור דגימות, המייצרות מעט או ללא חוטי DNA או כדורים גלויים בעדינות ובהדרגה. לבסוף, העבירו את כל ה-DNA התלוי לצינור פוגה. בשלב זה, הריכוז והטוהר של ה-DNA עשויים להיקרא על ידי NanoDrop או ספקטרופוטומטר אחר.

באופן כללי, טוהר ה-DNA צפוי להיות קרוב לזה של ה-DNA המופק ישירות מדם מלא המתקבל בצינורות אשלגן EDTA שנאספו למטרה היחידה של אחזור ריכוז ה-DNA תלוי בכמות החומר המוצא, אך יכול לנוע בין 50 ננוגרם למיקרוליטר לכמעט 1000 ננוגרם למיקרוליטר בממוצע בטווח של 200 ננוגרם למיקרוליטר. היתרון בשימוש בפרוטוקול זה הוא כפול. ראשית, הוא מאפשר לרופאים להשתמש בבדיקת דם אחת לשתי בדיקות קליניות במקום לקחת דם פעמיים.

שנית, זה מפשט את תהליך קבלת הגישה לתאים המכילים DNA על ידי שימוש בצינורות מפרידים מכניים מודרניים ולא בדורות קודמים. צינורות מפריד ג'ל עם הדור הקודם של הצינורות, גם מפריד הג'ל עצמו וגם קריש דם פעלו כמחסומים לתאים המכילים DNA. עם צינורות P 100, המפריד המכני מוסר בקלות באמצעות הפרדת צפיפות עם 17% סוכרוז.

זהו צילום מסך של קריאת טיפת הננו של מיצוי DNA ממוצע. באמצעות שיטה זו לכל דגימה P 109, המיצוי הביא לתמיסה של 250 מיקרוליטר של 209 ננוגרם לריכוז מיקרוליטר של DNA. היבול הכולל היה בסביבות 52 מיקרוגרם.

יחס שני 60 על פני 2 80, המדד העיקרי לטוהר ה-DNA נפל בטווח האופטימלי של 1.8 עד 1.9 ב-1.88. מדד משני לטוהר ה-DNA. יחס 2 60 על 2 30 היה קרוב לטווח הצפוי של 2 ל-2.2 ב-2.35.

אלה תוצאות אופייניות למדי. באופן מציאותי, מיצוי ישתנה בתפוקה באיכות, בהתאם לנפח ומצב הדם לפני המיצוי באמצעות אלקטרופורזה ג'ל סטנדרטית עם צביעת תיו ברומיד. בדיקות איכות נוספות מראות כי DNA גנומי המופק מצינורות P 100 שלם כמו DNA המופק מדם מלא.

זה ניכר מהפס העבה הבהיר המופיע בחלק העליון של כל נתיב המכיל DNA גנומי. ישנם שני יתרונות עיקריים לשימוש בפרוטוקול זה במקום שיטות קודמות. ראשית, הוא משלב מה שבדרך כלל יהיה שתי לקיחת דם לאחת.

שנית, פרוטוקול זה מהיר ונקי יותר מפרוטוקול הכולל צינורות מפריד ג'ל SST טיפוסיים על ידי הסרת הצורך בפירוק דם קרוש C באופן שגרתי, רופאים שואבים שתי צינורות דם כאשר נדרשות בדיקות גנטיות וסרולוגיות. בדרך כלל, צינור מפריד ג'ל SST הנקרא ראש זהב וצינור אשלגן EDTA הנקרא סירופ עליון סגול מוסר מצינור ה-SST ומופק DNA מהצינור העליון הסגול. שימוש בשיטה זו הכרחי רק כדי לצייר צינור P 100 אדום אדום אחד.

בעוד שמוסדות המכירים את שיטת מפריד הג'ל למיצוי DNA עשויים כבר לשאוב צינור אחד לבדיקות סרולוגיות וגנטיות כאחד. השיטה המוצגת כאן היא שיפור מצטבר אך משמעותי לעומת שיטות מפריד הג'ל הקיימות הללו. שתי השיטות דורשות הסרה של מפריד כלשהו, אם כי ג'ל נוטה להיות מבולגן יותר מג'ל פלסטיק.

צינורות מפרידים דורשים דם קרוש להיות הומוגני דרך רשת תיל לפני מיצוי ה-DNA. הומוגניזציה זו יכולה להיות מבולגנת, ומיצוי ה-DNA מוכיח את עצמו כקשה יותר כאשר תאי דם אדומים, שאינם מכילים דנ"א, נמצאים בכמות ניכרת. שיטת מיצוי P 100 זו מאפשרת הפרדה של DNA המכיל תאי דם לבנים מההמטוקריט, ומשאירה מעט תאי דם אדומים להפריע למיצוי ה-DNA.

למערכת זו של אחזור DNA מצינור פלזמה P 100 במקום צינורות מפריד ג'ל מהדור הקודם יש יתרונות רבים. צינורות P 100 מכילים EDTA, המעכבים אנדונוקלאז תלוי מגנזיום ונוגד קרישה למניעת קרישת דם. התוצאה הסופית היא שלמות DNA גבוהה יותר בפרוטוקול מיצוי קל בהרבה, כלומר הימנעות מפיצוץ והומוגניזציה של דם קרוש.

בנוסף, הדם המדולדל בפלזמה עשוי להיות מאוחסן ב-P מאה, נבדק ללא הגבלת זמן עד שלוש שנים עד למיצוי ה-DNA. יתר על כן, רופאים יפיקו נתוני מטופלים שימושיים יותר עם פחות לקיחת דם ולכן פחות לחץ על המטופלים שעוברים את ההליכים.