Granulocitos dependiente de autoanticuerpos inducidos por ampollas en la piel

Soy Cassian RO del Departamento de Dermatología de la Universidad de Fryberg, Alemania. La investigación de nuestro laboratorio se centra en la patogénesis de las enfermedades autoinmunes de la piel. Una de las enfermedades autoinmunes que nos interesan es la epidermólisis: QUISTA o EBAA es una enfermedad autoinmune específica de un órgano con un sistema de antígenos auto-anticuerpos bien definido y existen modelos exvivo y animales mutuamente complementarios para esta enfermedad.

La formación de ampollas de EBA puede reproducirse mediante la transferencia de anticuerpos PE contra el colágeno tipo siete en ratones. Por lo tanto, en este artículo de video, presentaremos la inducción y el análisis de la formación de ampollas en la piel en ratones mediante la transferencia pasiva de siete anticuerpos específicos de colágeno. Hola, soy King OBA del Grupo CAS en el Departamento de Dermatología del Hospital Universitario de Freberg.

En este vídeo, vamos a mostrarte cómo el modelo experimental de ratón de EBA es inducido por la transferencia pasiva de autoanticuerpos patógenos. Utilizamos este procedimiento cuando examinamos los posibles mecanismos patológicos en los trastornos autoinmunes de la piel o cuando buscamos epítopos patógenos. Al establecer el modelo de transferencia pasiva para EBA, se deben realizar algunos pasos adicionales antes de la inyección de autoanticuerpos en ratones palp de tipo salvaje.

Como primer paso, los conejos blancos se administran por vía subcutánea con el antígeno recombinante purificado. La IgG total del suero de conejo se aísla mediante cromatografía en columna de afinidad y posteriormente se inyecta en ratones de tipo salvaje. Las inyecciones se administran por vía subcutánea cada dos días cuatro veces, y la sangre se extrae a intervalos de dos días.

Los ratones son examinados diariamente para determinar su estado general y detectar evidencias de lesiones cutáneas. Durante el experimento, se calculan las puntuaciones clínicas que reflejan la actividad de la enfermedad para cada individuo y cuando, dos semanas después de la primera inyección, se sacrifican muestras de suero a los animales, así como se toman biopsias de piel y se analizan más a fondo. Después del tiempo de incubación, coloque una columna en un estante de soporte vertical, abra la parte inferior, golpee y recoja el flujo.

En tubos Falcon de 50 mili, mantenga el flujo hasta que tenga la confirmación del análisis de fluorescencia inmune de que se trata de un concentrado específico libre de anticuerpos IgG diluido por ultrafiltración en tubos especiales de amicon a 3.220 veces G durante 30 minutos a cuatro grados. La concentración consiste en dejar que el elato fluya a través de un filtro, descartar el flujo a través, volver a llenar el tubo y repetir hasta que no quede elu. Como último paso, lavar con PBS una vez, recoger el IgG concentrado amarillento y pegajoso, medir su concentración y almacenarlo en tubos debidamente etiquetados.

Antes de comenzar con la inyección real de los autoanticuerpos, evalúe su especificidad y su título mediante inmunofluorescencia indirecta. Incubar secciones criogénicas de piel leve normal con dilución en serie de la preparación concentrada de IGT y visualizar su deposición por un piso inmunológico simplemente se etiqueta como un documento de anticuerpos secundarios adecuado tomando fotografías antes de ir a la instalación de animales. Asegúrese de que el protocolo del animal esté escrito y que todos los materiales estén preparados.

Hojas de datos para la puntuación clínica de la actividad de la enfermedad con tubos marcados para muestras de sangre y tejidos. Solución de anticuerpos diluida para que se pueda inyectar el volumen adecuado. Anticoagulante y anestesiante frescos, instrumentos quirúrgicos esterilizados, así como jeringas.

Una pinza y una cámara digital también deben incluirse en la lista de verificación. Después de limpiar la superficie de trabajo y preparar la instalación de flúor, heparinizó la jeringa para el hilera de sangre y llenó una jeringa de insulina con solución de anticuerpos. Saca al ratón de la jaula, comprueba su número de identificación y pésalo.

Escriba todos los datos medidos y observados en los ratones, datos personales y hoja de puntuación clínica. Cuando el ratón ya esté bajo la órbita, mida el grosor de la oreja y luego verifique la apariencia de la piel y el pelaje del animal. Preste especial atención al área de la cabeza, la espalda, el vientre y las extremidades.

Extraer sangre de la vena de la cola a través de una pequeña incisión aplicada en su tercio superior, desinfectar el pelaje y, levantando la piel de la espalda, inyectar cuidadosamente la solución de IgG por vía subcutánea. Al volver al laboratorio, centrifugar la sangre durante 10 minutos a 1.200 veces la temperatura ambiente para obtener el suero. Transfiera la muestra a tubos debidamente etiquetados y guárdelos de acuerdo con el plan.

Examine a los ratones diariamente en busca de signos de enfermedad cuando comiencen a desarrollar eritema, alopecia y lesiones cutáneas. Además de medir su peso, evalúe la actividad de la enfermedad. Inyecte por vía subcutánea una cila de ketamina en la mezcla para poner al ratón bajo ssis.

Mida el grosor de la oreja y posteriormente inicie el chequeo general del cuerpo. Use pinzas curvas de punta fina para cepillar el pelaje en dirección opuesta a su crecimiento para exponer las posibles manchas afectadas. Trabaja alrededor de la cara.

El hocico del ojo se mueve hacia la parte externa e interna de la oreja, y luego revisa también el otro lado de la cabeza. Continúa con la mucosa de la cavidad bucal, la parte ventral del hocico y la zona abdominal. La zona dorsal lateral, dorsal y del cuello, así como las extremidades anteriores y de la mano.

Cuantifique la extensión de las lesiones registradas, los hallazgos en la forma basada en el área cubierta de piel, el porcentaje de ciertas partes del cuerpo y regiones en comparación con la superficie total de la piel del ratón. Se calcula una puntuación clínica de la enfermedad en función de la piel y el área total de la membrana mucosa afectadas. Finalmente, tome fotografías de las partes relevantes del cuerpo y las áreas enfermas.

Al final del experimento, sacrifique a los animales bajo necrosis profunda y recoja muestras de sangre y tejido. Las orejas, la cola y el esófago son los que se toman con más frecuencia en este entorno experimental. Cortar las biopsias de piel lesional en tiras más pequeñas.

Colóquelos en casetes de procesamiento e inclusión de histología y manténgalos en formaldehído al 3,7% hasta que se incorporen a la parafina. Posteriormente, procese las muestras para la tinción de h y e para el análisis de fluorescencia inmune. Incruste las tiras de piel peral en un medio de temperatura de corte óptima y use un criostato para cortar secciones de seis micrómetros.

Realizar un análisis de fluorescencia inmunitaria directa para visualizar los anticuerpos específicos de conejo unidos al tejido y los componentes del complemento de ratón como ensayo adicional, realizar Eliza utilizando placas de microtitulación recubiertas de antígeno recombinante y dilución en serie del suero de ratón para medir los niveles de autoanticuerpos circulantes. La transferencia pasiva de anticuerpos específicos de colágeno siete da lugar a una enfermedad en toda regla en ratones que se asemeja a niveles clínicos, histológicos e inmunopatológicos. Las ampollas, costras, erosiones y alopecia del EBA humano se desarrollan en la oreja alrededor de los ojos, el hocico, las patas, las patas y la espalda de los ratones.

La actividad de la enfermedad, que muestra una tendencia creciente a lo largo del experimento, se calcula en función de la piel y el área de la membrana mucosa afectadas. Resultados representativos que muestran el depósito de IgG específica de conejo y complemento C3 de ratón detectados por fluorescencia inmunitaria indirecta en la unión epidérmica dérmica. En crioterapia se muestran secciones de piel peral.

No se detectó IgG ni complemento C3 en los controles. El análisis histológico posterior de la piel lesional revela ampollas subepidérmicas e infiltrado inflamatorio. Sin embargo, la formación de ampollas subepidérmicas no se observa en el control cuando se realiza.

Como se muestra aquí, el modelo de autoanticuerpos en uso de ampollas subepidérmicas permitirá en gran medida la disección de las vías inflamatorias dependientes de ROY desencadenadas por autoanticuerpos, lo que resulta en daño tisular. Su diseño robusto y un protocolo sencillo lo hacen adecuado también para desarrollar y probar nuevas terapias antiinflamatorias en enfermedades inducidas por autoanticuerpos.