질병의 염색질 Proteomes의 정량 분석

이 절차의 전반적인 목표는 마우스 심장에서 염색질 결합 단백질을 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 심장을 균질화한 다음 심장핵 바이러스 자당, 밀도 구배를 분리함으로써 수행됩니다. 다음으로, 다음으로, 핵 플라스마는 염색질 분획(chromatin fraction)에서 분리됩니다.

그런 다음 염색질 펠릿에서 단백질을 추출하여 DNA에 느슨하게 결합된 단백질을 농축합니다. 마지막으로, 단백질은 DNA에 단단히 결합된 단백질을 농축하기 위해 다른 염색질 펠릿에서 추출됩니다. 궁극적으로, 정량적 label-free 질량 분석기 분석을 통해 다양한 생리학적 조건에서 핵 단백질체의 특성을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 방법은 염색질 리모델링이 심장 비대 및 부전에 어떻게 기여하는지와 같은 심장 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 성체 쥐를 희생하고 심장을 절제한 후 얼음처럼 차가운 PBS로 헹굽니다. 그런 다음 프로테아제와 인산가수분해효소 억제제 혼합물이 포함된 2ml의 용해 완충액과 함께 유리잔에 넣고 균질화합니다.

100 미크론 스트레이너를 통해 용해물을 붓고 이 시점부터 1.5 밀리리터 튜브에 여과액을 수집하고, 달리 명시되지 않는 한 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. 섭씨 4도에서 5분 동안 4, 000RPM으로 샘플을 원심분리합니다. 세포질을 함유한 supinate를 모아 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.

Reeses는 200마이크로리터의 용해 완충액에서 펠릿을 구부립니다. 새 튜브에 1ml의 자당 완충액을 추가하고 섭씨 4도에서 10분 동안 5, 000RPM의 전사 피펫 원심분리기를 사용하여 재부유액을 자당 패드 위에 부드럽게 층을 이룹니다. 상단의 박막과 멤브레인을 포함하는 자당 패드를 제거합니다.

핵을 포함하는 나머지 펠릿을 200마이크로리터의 얼음처럼 차가운 P-B-S-E-D-T-A 테이트로 헹구고, 핵을 포함하는 펠릿을 200마이크로리터의 세제 추출 버퍼에 넣고 샘플을 각각 10초 동안 두 번 와류로 헹굽니다. 10 분 동안 얼음에 표본을 놓고 그 후에 13, 4 섭씨 온도에 5 분 동안 000 분당 회전수에 그것을 분리기하십시오. 뉴클레오플라즘 단백질을 함유하고 있는 supinate를 제거하고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

펠릿을 얼음처럼 차가운 P-B-S-E-D-T-A로 헹구고 300마이크로리터의 Tris, S-D-S-E-D-T-A 버퍼에 재현탁합니다. 샘플을 각각 10초 동안 3-6회 초음파 처리합니다. DNA를 끊기 위하여는, syndications 분리기, 13, 4 섭씨 온도의 5 분 동안 000 분당 회전수 사이 얼음에 표본을 지키기.

분리된 단백질을 함유하고 있는 supinate를 유지하고 섭씨 영하 80도에서 보관하여 DNA에 단단히 결합된 히스톤과 같은 단백질을 농축합니다. 쥐 PARP에서 분리된 성인 심장 또는 심근세포부터 시작하여 염색체를 분리하기 위해 별도의 분획을 수행하여 400마이크로리터의 0.4N 황산 및 와류에서 염색질 펠릿을 삼중화합니다. 덩어리를 제거하려면, 섭씨 4도의 샘플을 30분 동안 회전시키거나 배양 후 하룻밤 사이에 섭씨 4도의 10분 동안 16, 000G에서 회전하여 핵 파편을 제거합니다.

supnate를 새 튜브로 옮기고 132 마이크로 리터의 트리클로로 아세트산을 샘플에 적가합니다. 튜브를 여러 번 뒤집어 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 회전 후 supinate를 버리고 얼음처럼 차가운 아세톤을 사용하여 펠릿이 들어있는 히스톤을 부드럽게 헹구고 회전시킵니다.

다시 말하지만, 아세톤을 반복하고 펠릿을 세척하고 공기 중에서 건조시킨 후 다시 현탁시킵니다. 100 마이크로 리터의 Triss S-D-S-E-D-T-A 버퍼. 하나의 어금니 트리스를 사용하여 pH를 8로 조정합니다.

샘플을 수조에서 15분 동안 초음파 처리합니다. 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 질량 분석법을 사용하여 순도를 측정하고 여기에 표시된 단백질을 식별하기 위한 분석을 수행합니다.

HMGB one 단백질에 매핑된 단일 펩타이드에 대한 추출된 추출 크로마토그램이 중첩되었습니다. 각 크로마토그램은 서로 다른 염색질 샘플에서 추출되며 샘플을 획득한 마우스의 생리학적 상태를 나타내기 위해 색상으로 구분되어 있습니다. 각 생리학적 상태, 기저 심장 비대 및 심부전에 대해 세 가지 생물학적 복제를 분석했으며 각 샘플을 두 번 분석하여 총 18 크로마토그램을 제공했습니다.

곡선 아래 면적을 적분함으로써 각 반복실험에 대한 상대적 풍부도를 결정할 수 있습니다. 이 패널에서는 세 가지 생리학적 조건 각각에 대해 6번의 반복실험을 평균화하여 전반적인 풍부도 값을 제공했습니다. 이 분석에서 볼 수 있듯이 HGB one의 풍부함은 질병이 진행되는 동안 변화한다는 것이 분명합니다.

이 펩타이드의 단편화 스펙트럼은 아미노산 서열을 확인하고 H MG B one 단백질에 매핑할 수 있도록 합니다. 대조적으로, 단백질 히스톤 H 4와 다른 펩타이드를 정량화하면 그 풍부함이 질병에 따라 변하지 않는다는 것을 보여줍니다. 우리는 통계적 분석을 사용하여 서로 다른 생리학적 상태 사이에서 관찰되는 펩타이드 풍부도의 변화의 재현성을 분석할 수 있습니다.

먼저, 각 복제에서 확인된 모든 펩타이드의 풍부도를 분산분석한 후 주성분 분석 또는 PCA를 수행합니다. 이 플롯에서 기술적 복제와 생물학적 복제의 클러스터링은 질량 분석법으로 감지된 풍부도 변화가 서로 다른 질병 상태 간에 일관되고 재현 가능하다는 것을 확인합니다. 파란색의 기저, 비대, 녹색의 적색 실패, 결과의 정량화 및 재현성과 동일한 중요성은 핵 하위 분획에 의해 가능해진 핵 단백질체의 적용 범위가 증가한다는 것입니다.

이 그림은 전체 핵에 대한 분석만으로는 개별 구획의 개별 분석을 결합할 때 식별된 핵 단백질의 대다수조차 밝혀낼 수 없다는 것을 보여줍니다. 또한, 서로 다른 분획 간의 적당한 중복은 핵 기능 및 유전자 조절에 대한 통찰력을 더하기 위해 이러한 구획을 개별적으로 고려하는 것의 생물학적 관련성을 보여줍니다. 마지막으로, 산 추출 또는 세제로 추출된 염색체를 특이적으로 분별하는 능력은 히스톤과 같은 주요 염색질 구조 단백질을 풍부하게 하여 각 변이체 및 동형에 대한 특정 항체 없이 단백질 그룹에 대한 보다 집중적인 질량 분석 분석을 가능하게 합니다.이 절차를 시도하는 동안 질량 분석기에서 분석할 모든 샘플에 케라틴 오염이 없는지 확인하는 것이 중요합니다.

이는 단백질 분리 후 후속 단계에서 특히 중요합니다.