Name: 一个海兔夜蛾 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: 学习海兔体外神经电生理记录技术，通过钩状电极记录神经、肌肉及单个神经元的电活动，观察摄食器官运动，分析咬食、吞咽和排斥等摄食行为模式。该方法为研究神经控制摄食行为提供了重要手段。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 NS047073 和美国国家科学基金会（NSF）基金项目 DMS1010434 资助。

<ol><li>Neustadter, D. M., Herman, R. L., Drushel, R. F., Chestek, D. W., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinematics+of+multifunctionality%3A+comparisons+of+biting+and+swallowing+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">The kinematics of multifunctionality: comparisons of biting and swallowing in Aplysia californica.</a> J. Exp. Biol. 210, 238-260 (2007).</li>
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<li>Cullins, M. J., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrode+fabrication+and+implantation+in+Aplysia+californica+for+multi-channel+neural+and+muscular+recordings+in+intact%2C+freely+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals.</a> J. Vis. Exp. (40), e1791(2010).</li>
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<li>Church, P. J., Lloyd, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+multiple+identified+motor+neurons+recorded+intracellularly+during+evoked+feedinglike+motor+programs+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophys%22%5BJournal%5D)">Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia.</a> J. Neurophys. 72, 1794-1809 (1994).</li>
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<li>Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+buccal+motor+programs+elicited+by+a+cholinergic+agonist+applied+to+the+cerebral+ganglion+of+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica.</a> J. Comp. Physiol. A. 179, 509-524 (1996).</li>
<li>Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+behavior+in+Aplysia%3A+A+simple+system+for+the+study+of+motivation%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Biol%22%5BJournal%5D)">Feeding behavior in Aplysia: A simple system for the study of motivation.</a> Behav. Biol. 10, 1-26 (1974).</li>
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<li>Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+an+identified+histaminergic+neuron%2C+and+its+possible+role+in+arousal+of+feeding+behavior+in+semi-intact+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia.</a> J. Neurosci. 6, 2403-2415 (1986).</li>
<li>Jing, J., Weiss, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+variants+of+a+motor+act+in+a+modular+and+hierarchical+motor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network.</a> Curr. Biol. 15, 1712-1721 (2005).</li>
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<li>Morgan, P. T., Jing, J., Vilim, F. S., Weiss, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuronal+and+peptidergic+control+of+motor+pattern+switching+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Interneuronal and peptidergic control of motor pattern switching in Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 87, 49-61 (2002).</li>
<li>Jing, J., Cropper, E. C., Hurwitz, I., Weiss, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+construction+of+movement+with+behavior-specific+and+behavior-independent+modules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The construction of movement with behavior-specific and behavior-independent modules.</a> J. Neurosci. 24, 6315-6325 (2004).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

以往的研究已对完整动物以及简化制备标本（如离体神经节）中的Aplysia运动程序进行了表征。在完整动物中，尽管已获得单个神经元的记录5，但此类实验极为困难，且在摄食过程中无法将电极从一个神经元移动到另一个神经元。在离体神经节中，则无法观察由神经活动引发的摄食运动。悬浮的口球囊制备标本填补了这两种极端情况之间的空白。
在之前的研究中曾使用过其他半离体 preparations，但悬浮的口球 preparation 具有显著优势。在一种半离体 preparation 中，唇部和口球仍保持连接，但该 preparation 结构过于简化，无法观察完整的摄食运动14。一种摄食头部 preparation15,16 可实现体外（in vitro）观察摄食运动。然而，与本文所述的悬浮口球 preparation 相比，该摄食头部 preparation 的制备更为复杂，且仅能接触脑神经节中的单个神经元，而无法接触口神经节中的神经元。摄食头部 preparation 的优势在于，其保留了唇部和前...

<table><tbody><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671</td><td>生物级，认证</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td>ACS认证</td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>Acros Organics</td><td>19753</td><td>99%</td></tr><tr><td>七水合硫酸镁</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63</td><td>ACS认证</td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79</td><td>ACS认证</td></tr><tr><td>葡萄糖（右旋糖）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>BioXtra</td></tr><tr><td>MOPS缓冲液</td><td>Acros Organics</td><td>17263</td><td>99%</td></tr><tr><td>卡巴胆碱</td><td>Acros Organics</td><td>10824</td><td>99%</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255</td><td>认证级</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA49</td><td>认证级</td></tr><tr><td>单通道毛细玻璃管</td><td>A-M Systems</td><td>6150</td><td></td></tr><tr><td>Flaming-Brown 微电极拉制仪 P-80/PC 型号</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>使用灯丝：FT345B</td></tr><tr><td>漆包不锈钢丝</td><td>California Fine Wire</td><td></td><td>0.001D，h型涂层</td></tr><tr><td>家用 Silicone II 胶水</td><td>GE</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Duro Quick-Gel 瞬干胶</td><td>Henkel corp.</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>A-M Systems 1700 型放大器</td><td>A-M Systems</td><td></td><td>滤波设置：300-500 Hz 神经，10-500 Hz I2 肌肉</td></tr><tr><td>Pulsemaster 多通道刺激器</td><td>World Precision Instruments</td><td>A300</td><td></td></tr><tr><td>刺激隔离器</td><td>World Precision Instruments</td><td>A360</td><td></td></tr><tr><td>AxoGraph X</td><td>AxoGraph Scientific</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Veeder-Root 累计计数器</td><td>Danaher</td><td>C342-0562</td><td></td></tr><tr><td>金质连接插针</td><td>Bulgin</td><td>SA3148/1</td><td></td></tr><tr><td>金质连接插座</td><td>Bulgin</td><td>SA3149/1</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅橡胶弹性体</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 x 50 mm 结晶皿</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高真空润滑脂</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-375D</td><td></td></tr><tr><td>显微固定针</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>模型黏土</td><td>Sargent Art</td><td>22-4400</td><td></td></tr><tr><td>丝线缝合线</td><td>Ethicon</td><td>K89OH</td><td></td></tr><tr><td>Whisper 气泵</td><td>Tetra</td><td>77849</td><td></td></tr><tr><td>水族管路</td><td>Eheim</td><td>7783</td><td>12/16 mm</td></tr><tr><td>Elite 气石</td><td>Hagen</td><td>A962</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Yaki 寿司海苔</td><td>Rhee Bros</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes 纸巾</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于在 aplysia californica 中诱发并记录摄食运动程序及其生理运动的 体外 实验装置

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

多功能性，指单一外周结构产生多种不同行为的能力1，使动物能够快速适应变化的环境。海洋软体动物 Aplysia californica 为研究多功能性提供了一个易于操作的系统。在摄食过程中， Aplysia 利用同一摄食器官——口球，产生多种截然不同的行为。控制这些行为的神经节包含多个体积较大且已被鉴定的神经元，可进行电生理学研究。这些神经元的活动表现为两类运动程序，根据控制食物抓握器关闭的神经活动与控制抓握器伸出或缩回的神经活动之间的时序关系，可将运动程序分为摄食性和排飞性两类。2然而，在离体神经节中，能够产生这些行为的肌肉运动并不存在，因此更难确定所观察到的运动程序是否真实行为的对应表现。 体内，已获得与摄食程序相对应的神经和肌肉记录2,3,4，但直接记录单个神经元的活动非常困难5此外， 体内，摄食程序可进一步分为咬合和吞咽1,2，这一区别在以往大多数已描述的方法中均难以实现 体外 制备物
悬置的口器团块制备（图1）填补了离体神经节与完整动物之间的空白。在此制备中，摄食行为（包括咬合和吞咽）以及排食行为（排斥）均可被诱发，同时可使用细胞外电极对单个神经元进行记录和刺激6。与这些不同行为相关的摄食运动可以被记录、量化，并直接与运动程序相关联。在悬置的口器团块制备中，所观察到的运动程序似乎比在离体神经节中诱发的运动程序更接近于in vivo状态下观察到的程序。因此，该制备中的运动程序可更直接地与in vivo行为相对应；同时，单个神经元相较于完整动物更易于进行记录和刺激。此外，作为离体神经节与完整动物之间的中间步骤，来自悬置口器团块的研究结果有助于解释在更简化或更完整条件下所获得的数据。悬置的口器团块制备是研究Aplysia中神经对多功能性控制的一个有效工具。

当细胞外电极置于神经元胞体上方并用于刺激该神经元时，可在胞体记录通道与该神经元投射所支配的神经上观察到一一对应的放电关系（图6，左图，对已鉴定神经元B9的刺激）。在施加电流时（图中时间点1），胞体通道（顶部通道）被设置为刺激模式，随后迅速切换至记录模式（时间点2）。通过保持电极位置不变，可在运动程序期间持续记录该神经元的活动（图6，右图），同时记录I2肌肉、齿舌神经以及左右两侧的口前神经2和3的活动。
图7展示了通过向脑神经节施加卡巴胆碱并在此期间将海藻条放入齿舌颚中以诱导卡巴胆碱引发的摄食行为后，记录到的一系列吞咽模式的视频图像。在7A中，齿舌外伸以夹住海藻；在7B中，齿舌回缩，将海藻拉入口中。视频与电生理记录可直接相互同步；图7中的静态图像对应于图6右侧面板中标注的时间点A和B。
<p class="jove_content" fo:k...

我们描述了一种从神经、肌肉及已鉴定的单个神经元进行细胞外记录和刺激的技术 体外 在摄食装置中诱发并观察不同类型的摄食行为 Aplysia.

一种用于在 Aplysia californica 中诱发并记录摄食运动程序及其生理运动的 体外 实验装置

多功能性，即一个外周结构产生多种不同行为的能力，使动物能够快速适应其行为……

本实验的总体目标是记录摄食运动程序期间摄食器官相关的神经、肌肉和神经元的电活动及其相应运动。首先，从麻醉后的无足目动物体内取出口球部，并将钩状电极连接至关键的神经和肌肉。第二步是将口球部置于记录皿中，并为神经节的细胞外记录做好准备。接下来，使用细胞外电极定位目标神经元。最后一步是诱导并记录摄食运动程序，例如咬合、吞咽和排斥反应。最终，通过离体悬置的口球组织制备，展示口球在类似摄食运动过程中神经、肌肉及单个神经元的活动情况。与现有的孤立神经节研究等方法相比，该技术的主要优势在于，可以从神经、肌肉和单个神经元记录到的信号直接关联到摄食器官的运动。协助演示该实验操作的是我们实验室的研究生 huu。开始操作时，将一只健康的 200 至 300 克重的 Plegia 置于解剖盘中，通过注射约相当于其体重 50% 的等渗氯化镁溶液进行麻醉。在动物尾部附近完成首次注射后，轻轻按摩动物体表，以促进氯化镁的扩散。根据需要，在动物头部附近追加注射。当动物对轻柔的触觉刺激不再反应时，将其背侧朝上固定在解剖盘中。在尾部插入一枚大头针，并在每个前侧触手各插入一枚大头针。然后使用镊子夹住并提起动物头部中央的皮肤。在鼻角四足处后方，沿动物头部做冠状切口，切口位置位于所夹持点的后方。接着，在鼻角四足之间向口部方向做正中矢状切口，以暴露口前庭结构。接下来，将皮肤瓣从口咽部肌肉团块上拉开，并切断连接至体壁的神经和结缔组织。为将此皮肤瓣与口咽部肌肉团块完全分离，请注意不要切断任何属于口咽部肌肉团块本身的神经或组织。随后，抓住并固定食管。在所夹持位置的后方切断食管。上提食管，并将口球后方的结构一同抬起。脑神经节、侧神经节和足神经节形成一个环状结构，其中脑神经节通过脑-口神经连索与口神经节相连。将这些神经节环保留附着在口球上，并切断从这些神经节投射到身体其他部位的所有神经。然后切断口球周围的结缔组织，随着口球与身体的连接逐渐减少，继续将其向上提起。当口球仅与口部相连时，捏住食管和口球。直接向前，在口器前方做最后一道切割，以分离口器肌肉团与身体。将口器肌肉团置于50%等渗氯化镁溶液和50% SIA生理盐水的混合溶液中，以便在连接电极时保持部分麻醉状态。随后，将含有溶液的口球置于培养皿中，用剪刀从口球腹面穿过口动脉处剪开。接着剪断脑神经节与足神经节和侧神经节之间的连接，以去除后者。保留脑神经节通过CBCs与口神经节及口球相连，切断脑神经节与口球之间的其他连接。将食管和唾液腺修剪至较短长度。在此步骤中，将钩状电极连接至眼神经、两块口神经二和三，以及口神经二的 A 分支。采用类似于 JoVE 出版物中 Collins 和 Shield 所演示的方法，此处简要总结。每次电极脱离时，将电极置于神经或肌肉附近，把目标神经放入钩状电极中，并使用操作器轻轻提起。然后用无尘纸擦拭神经部位使其干燥。在钩住的神经上涂抹适量快速凝胶胶水，确保钩状电极完全被胶水覆盖，而参考导线的尖端不被胶水覆盖。接下来，使用带有聚乙烯管附件的注射器将溶液从培养皿中施加到胶上，以促使胶的表面固化。下一步是准备一个圆形的100毫米×50毫米的派热克斯（Pyrex）记录皿，用作记录室，在大脑室与弯曲室之间的凹槽处用移液器吸头涂抹一层薄薄的真空脂，以尽量减少泄漏。然后用普雷斯西亚（plescia）生理盐水填充前室。将口器肌肉群小心地从培养皿转移至圆形派热克斯玻璃皿的前室，并确保没有任何电极被拉紧，以免损伤神经。如果需要将玻璃皿转移至另一台双目解剖显微镜，务必格外小心钩状电极。用于减薄鞘膜。将两侧口器团块上的电极分别归为一组。用手小心抓住覆盖在连接针脚上的实验室胶带固定电极，再次确保没有任何电极被过度拉紧。当培养皿置于显微镜下时，应将电极轻轻搭在培养皿边缘，并在实验间歇及各阶段之间让其自然垂放在平台上。使用水族箱用气石对口器团块腔室中的生理盐水进行通气。接下来，将脑神经节固定在后室中，使CBCs穿过切口。在CBCs上再涂抹一些真空润滑脂。然后向培养皿的两部分均加入更多的SIA生理盐水，使神经节完全浸没。确保生理盐水的液面低于脑部室与口部室之间真空脂的高度，以防止室间发生泄漏。此时，口部肌团应位于前室的底部。接下来，将口部神经节固定在中间平台上，以避免损伤仍与口部肌团相连的神经。仅将针插在两根神经之间的鞘膜上。然后在口部神经节（CBCs）两侧再加两枚针以拉伸并固定组织。根据目标神经元的位置，保持口部神经节平坦或适当旋转。为了旋转颊神经节，使用一对精细镊子夹住部分多余的 CBC 鞘膜，并将其固定在第二颊神经与第三颊神经之间。随后，原本靠近后腔室、从颊神经节顶部难以触及的大部分细胞体即可被观察到。最后，在靠近口球侧的颊神经节鞘膜上添加两根固定针。为尽量减少口侧神经节的移动，用镊子夹住靠近后室的口侧神经节鞘膜，并用精细剪刀剪除多余的鞘膜，注意不要暴露神经元胞体。为尽量减少损伤，仅去除在完成鞘膜变薄后为观察到神经元胞体所必需的那部分鞘膜即可。将所有电极针连接至与放大器相连的电缆插座上。确保电极未被过度拉紧，并正确连接至相应的电缆，且极性正确，以冲洗掉残留的氯化镁。用新鲜的SIA生理盐水替换口球腔室中的SIA生理盐水。接着，将丝线缝合线穿过口球前端的软组织，并位于颌软骨背侧。使用两块油灰将缝合线固定在培养皿边缘，从而从其前端位置悬挂口面团。使用操纵器夹持玻璃细胞外电极，使电极尖端靠近口侧神经节。为定位并鉴定神经元，需将细胞外电极的尖端轻轻下移至被膜表面。将电极置于神经元胞体上方。施加刺激电流后，将用于刺激胞体的通道切换至记录模式，以记录细胞外电极上的放电活动以及神经上的相应活动，从而诱导排斥反应。例如，通过以2赫兹、1毫秒脉冲组成的长串刺激运动程序，激活口神经2A，产生ees放电模式。这些模式会在刺激期间持续出现，并可能在刺激结束后短时间内仍然持续。为诱导类似咬合的运动程序，将少量固体蜗牛素晶体直接放置于脑神经节上。重复的模式通常在五分钟内开始，持续大约10到15分钟，然后逐渐减弱以诱导吞咽。与运动程序类似，施加caracol刺激，并等待口球产生强烈的咬合动作。然后在一次咬合过程中，将一条海藻放入动物口中，使其抓住海藻。以下是刺激和记录已鉴定的运动神经元 B9，以及在同一神经元、I2 肌肉和摄食运动程序期间多条神经的记录。以下视频图像取自同一系列的运动程序。通过将卡巴胆碱施加于脑神经节，并在卡巴胆碱诱导的咬合期间随后将海藻条置于抓握器中，从而诱发吞咽模式。在此图像中，齿舌伸出以抓取海藻；在此图像中，齿舌回缩，将海藻拉入口中。观看本视频后，您应充分了解如何建立离体悬吊口神经节复合体标本，并记录体外摄食运动节律。

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学习海兔体外神经电生理记录技术，通过钩状电极记录神经、肌肉及单个神经元的电活动，观察摄食器官运动，分析咬食、吞咽和排斥等摄食行为模式。该方法为研究神经控制摄食行为提供了重要手段。

一种用于在 Aplysia californica 中诱发并记录摄食运动程序及其生理运动的体外实验装置

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一种用于在 Aplysia californica 中诱发并记录摄食运动程序及其生理运动的 体外 实验装置

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一种用于在 Aplysia californica 中诱发并记录摄食运动程序及其生理运动的体外实验装置