Hippocampal 인슐린 Microinjection 및 생체에 Microdialysis

이 절차의 전반적인 목적은 행동 테스트 중 해마 대사를 측정하는 것입니다. 이것은 미세투석 가이드 캐뉼라로 잘 다루어진 동물을 외과적으로 준비함으로써 이루어집니다. 검사 당일에는 미세 투석 프로브를 캐뉼라에 삽입하고 PERFUSE 8 흐름을 확인합니다.

다음으로, 프로브는 동물이 제어실에 앉아 있는 동안 평형을 이루도록 합니다. 궁극적으로 적절한 분석 방법, 예를 들어 포도당 산화효소, NADP, N-A-D-P-H 반응 및 독감 측정 분석이 있습니다. 검사 기간 동안 신진대사 및/또는 신경화학적 방출 수준을 보여주기 위해 포도당을 측정하는 경우, 이 기술의 가장 어려운 측면 중 하나는 미세투석 튜브를 취급할 때 필요한 주의이며, 주의를 기울이지 않으면 튜브를 씹거나 선을 엉키는 경우가 많습니다.

그래서 제가 행동 테스트 중 해마 미세투석을 처음 사용한 것은 대학원 연구를 할 때였는데, 기존 모델이 포도당을 공급하는지 확인하고 싶었습니다. 실제로 포도당에 의한 기억력 향상에 관한 알려진 심리학 데이터와 양립할 수 있었습니다. 이 방법론을 통해 우리는 실제로 뇌에 적용된 포도당의 기존 모델이 완전히 잘못되었다는 것을 보여줄 수 있었습니다.

표준 수술 절차에 따라 동물을 준비하고, 두개골을 노출시키고, 캐뉼라 배치를 위해 구멍을 뚫습니다. 미리 결정된 좌표에 캐뉼라를 삽입한 다음 목표 깊이까지 천천히 내립니다. 올바르게 배치되면 치과용 시멘트로 캐뉼라를 제자리에 고정합니다.

필요한 경우 멸균 수술용 봉합사를 사용하여 상처를 봉합합니다. 마지막으로, 스타일은 캐뉼러 개통성을 유지하는 데 사용됩니다. 다음으로, 미세 투석에 사용할 PERFUSE eight를 준비합니다.

최적의 결과를 위해서는 정확한 유체 조성이 필수적이라는 점에 유의해야 합니다. 검사 당일에 소 혈청 알부민 BSA를 첨가하고 완전히 용해시켜야 합니다. 전처리 후 PERFUSE eight은 0.2 미크론 필터를 통해 여과해야 합니다.

다음으로, 준비된 A ECF의 분취액을 사용하여 뇌에 투여할 치료법(있는 경우)을 준비합니다. 여기서 인슐린은 해마로 전달될 준비가 되어 있습니다. 새로운 미세투석 프로브와 라인은 검사 전날에 준비해야 합니다.

유입 및 유출에 대해 두 개의 별도 선을 만듭니다. PE 50 튜빙을 사용하여 1미터 길이의 FEP 튜빙 두 개를 연결하고 라인 사이에 데드 스페이스를 최소화합니다. PE 50 커넥터에 쉽게 삽입할 수 있도록 비스듬한 끝을 만들기 위해 그림과 같이 튜브를 다듬어야 합니다.

유입 튜브를 멸균 여과 탈이온수로 채워진 1mL 해밀턴 주사기에 연결하고 프로브를 다른 쪽 끝에 부착하여 동물이 측정하는 동안 자유롭게 움직일 수 있도록 합니다. 유입 및 유출 라인을 2채널 스위블에 연결합니다. 다음으로, 유출 튜브를 펌프에 연결하고 프로브의 유출 튜브에서 탈이온수가 나올 때까지 분당 1.5마이크로리터로 실행합니다.

펌프를 끄고 유출 튜브와 샘플 수집 튜브 사이의 다른 라인을 연결합니다. 튜브를 통해 5ml를 통과시키고 프로브를 멸균 탈이온수가 들어 있는 바이알에 밤새 넣어 프로브 팁이 항상 젖은 상태로 유지되도록 합니다. 실험 24시간 전, 더미 탐침을 제거하고 이 용도로만 사용되는 미세투석 프로브를 삽입하여 피험자를 사전에 Roe-Ed합니다.

그 후 10분 동안 더미 스타일로 교체하고 쥐를 우리에 다시 넣습니다. 또는 이 s에서 새 프로브를 사용하십시오.tage 및 측정을 수행할 때까지 제거하지 않고 제자리에 두십시오. 다음 날.

미세투석 당일, Hamilton 주사기와 섬광 바이알에 여과된 A ECF를 채우고 펌프가 1시간 동안 평형을 이룰 때까지 기다립니다. 필요한 경우, 두 번째 Hamilton 주사기에 준비된 처리제를 채우고 주사기 펌프에 넣습니다. 이 절차에서 성공의 열쇠는 침착함을 유지하고 동물을 실제로 광범위하게 다루는 것입니다.

그러니 침착함을 유지하고, 천천히 그리고 정확하게 움직이고, 무엇보다도 연습을 하십시오. 평형이 완료되면 더미 탐침을 제거하고 평형 미세투석 프로브를 캐뉼라를 통해 쥐의 뇌에 부드럽게 삽입합니다. 쥐의 집 침구가 들어 있는 투명한 플라스틱 상자에 쥐를 넣습니다.

튜브의 균형을 맞춰야 합니다. 물이 채워진 1.6밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브를 케이지 외부의 튜브에 부착하여 중력이 미세 투석 라인이 꼬이지 않도록 유지하지만 가르치지 않도록 합니다. 프로브와 랫드가 2시간 동안 평형을 이루도록 합니다.

이 기간이 시작될 때 Perfuse eight의 흐름이 차단 해제되었는지 확인합니다. 이를 위해 정의된 기간 동안 PERFUSE 8 유출을 수집하고 샘플의 무게를 측정하여 샘플을 수집하기 전에 예상 부피가 시스템에서 빠져나가고 있는지 확인합니다. 검체 투석과 채취 간의 상관관계가 정확하게 계산되었는지 확인합니다.

여기에서 프로브와 수집 지점 사이에 분당 30마이크로리터의 속도로 1.5마이크로리터의 부피가 있습니다. 샘플이 뇌를 빠져나갈 때부터 수집될 때까지 20분의 지연이 있습니다. 평형 기간이 지나면 쥐가 가정 챔버에서 쉬는 동안 최소 3개의 샘플을 수집합니다.

안정적인 측정 기준선을 설정하기 위해 행동 테스트를 하기 전에 치료제가 뇌에 전달되는 시기를 신중하게 계획하십시오. 따라서 주사기 끝과 동물의 뇌로 들어가는 프로브 사이에 30마이크로리터의 부피가 있는 이 설정에서는 20분 전에 처리 주사기를 넉넉한 8개의 처리 용액으로 변경합니다. 우리는 그 치료법이 해마에 도달하기를 원합니다 주사기를 바꾸기 위해.

control perfuse eight syringe에서 유입 라인을 분리하고 treatment perfuse eight syringe에 빠르게 연결하기만 하면 됩니다. 이 작업은 PERFUSE 8 흐름의 중단을 방지하는 데 5초 이상 걸리지 않아야 합니다. 적절한 시간에 숙련도를 떨어뜨릴 수 있는 기포가 유입되지 않도록 주의하십시오.

치료 분만 후 쥐를 선택한 행동 테스트 장치로 부드럽게 이동합니다. 여기에서 자발적인 교대는 팔뚝과 모양의 미로에서 측정됩니다. 동물이 20분 동안 미로를 자유롭게 탐험할 수 있도록 합니다.

양자리의 팔 순서와 타이밍을 비디오 녹화를 사용하거나 샘플을 수집하기 위해 손으로 기록하십시오. 이 기간 동안 유출 튜브를 새 수집 튜브로 이동합니다. 5분마다 튜브가 자유롭게 움직이도록 튜브를 잡습니다.

쥐의 움직임을 방해하거나 동물 앞에서 움직이지 않아야 하며 주의가 산만해지면 자신의 움직임이 쥐의 행동에 영향을 미치지 않도록 가만히 있어야 합니다. 실험이 끝나면 미로에서 쥐를 조심스럽게 꺼내 제어실로 되돌려 놓는다. 작업 수행에서 회복하는 기간을 커버하기 위해 최소 4개의 샘플에 대한 미세 투석 샘플 수집을 계속합니다.

원하는 샘플을 채취한 후 동물의 머리에서 프로브를 부드럽게 제거하고 보관 바이알에 넣습니다. 동물을 우리 집으로 돌려보내고 실험 후 건강이나 행동에 변화가 있는지 면밀히 관찰합니다. 마지막으로, 미생물 성장을 방지하기 위해 음극 용액이 들어 있는 주사기로 전환하여 튜브를 세척합니다.

이 예는 해마 ECF 포도당의 딥과 관련된 작업을 보여줍니다. 회색 상자는 동물이 미로에서 보낸 시간을 나타냅니다. 보라색 선은 미로 테스트를 하지 않은 동물의 해마 포도당을 나타내고, 빨간색 선은 팔뚝 자발적인 교대 작업을 수행하는 동물을 나타냅니다.

주황색 선은 이 작업의 더 쉬운 세 팔 버전을 수행하는 동물의 측정값을 나타냅니다. 인슐린 투여 후 해마, 포도당 및 젖산의 변화가 여기에서 볼 수 있습니다. 이러한 변화는 어떠한 행동 테스트 없이도 볼 수 있으며, 따라서 기준선 조건에서 인슐린 단독의 영향을 반영합니다.

이 절차를 수행할 때 침착함을 유지하는 것이 정말 중요합니다. 쥐는 스트레스 실험을 알아차리고 동요하게 될 수 있으며, 이는 훨씬 더 어렵게 만들 수 있으며 결과를 혼란스럽게 만들 수 있습니다. 이러한 기술의 조합은 행동 과정에 대한 정확한 신경 화학적 조사를 가능하게 했습니다.

이제 유사한 기술이 인간 환자에게도 사용됩니다. 예를 들어, 발작 초점을 국소화하기 위해 전극을 이식한 간질 환자는 대사 측정을 허용하기 위해 미세 투석 캐뉼라를 이식할 수도 있습니다.