4D изображений агрегации белков в живых клетках

Эта экспериментальная система получает 3D-флуоресцентные изображения с высоким разрешением в живых клетках для мониторинга и анализа пространственно-временной динамики контроля качества сворачивания белка. Во-первых, подготовьте клетки к изучению быстро движущихся белковых комплексов. Получение стека изображений Z с высоким разрешением Z.

Затем получите временной ряд, состоящий из Зака, визуализируйте полученные изображения в 3D-фильме и проанализируйте полученные изображения. В конечном счете, четырехмерная визуализация позволяет отслеживать динамические и переходные явления в клетках в различных условиях. Основное преимущество четырехмерной визуализации перед существующими методами, такими как широкопольная микроскопия и покадровая съемка, заключается в том, что она позволяет одновременно визуализировать динамику и пространственно-временное распределение всей популяции белков в клетке с высоким разрешением.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной биологии агрегации белков, контроля качества и сворачивания белков. Это очень динамичные и быстротечные процессы. Следовательно, без высокого временного и пространственного разрешения многие из них было бы невозможно наблюдать.

Этот метод может дать представление о контроле качества агрегирования. Это также может произвести революцию в изучении взаимодействия и динамики белков. Как правило, люди, не знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что съемка 3D-фильмов с эндогенно помеченными или низкоэкспрессирующимися белками требует стабильности системы.

Высокая чувствительность и низкое фотообесцвечивание Трансформируйте штаммы дрожжей с экспрессирующей плазмидой для синтеза белка Fluor, связанного с цитозольным сенсорным белком, похожим на чувствительный к температуре мутант UBC nine. Выращивают дрожжи в синтетических средах, содержащих 2% рафинозы, в течение 24 часов, затем снова разбавляют до 2% среды, содержащей галактозу, на ночь, разбавляют запрашиваемый штамм до наружного диаметра 600 приблизительно 0,2 и культивируют в течение четырех-шести часов до тех пор, пока культура не достигнет внешнего диаметра 600 между 0,8 и 1,0 за 30 минут до визуализации. Подавите экспрессию с помощью синтетических сред с добавлением 2% глюкозы.

Этот шаг позволяет контролировать только уже транслируемый и свернутый пул экспресс-белка. Теперь подвергните клетки тепловому удару в течение 20 минут при температуре 37 градусов по Цельсию. Чтобы вызвать неправильное сворачивание, выберите подходящую пластину для сохранения фокусировки во время съемки четырех D.Imaging.

Накройте дно тарелки 0,25 миллиграмма на миллилитр кон А на 10 минут. Разъем А используется для прикрепления ячеек к предметному стеклу, что позволяет следить за одной ячейкой с течением времени. Отсадите кон А и стрелкуйте, просушите пластину в химическом колпаке.

Затем добавьте 200 микролитров образца дрожжей. Инкубируйте в течение 15 минут, чтобы клетки могли прилипнуть к планшету. Выполните три промывки с помощью среды, чтобы получить один слой клеток для визуализации дрожжей.

Используйте конфокальный микроскоп с несколькими нестандартными модификациями, как подробно описано в сопроводительном тексте. В этой системе визуализации дрожжей используется до четырех лазеров и до четырех фотоумножителей, оснащенных фильтрами. Большая часть изображений сделана с помощью зеленого фильтра для EGFP и красного фильтра для черри и томата TD.

Кроме того, оснастите конфокальный аппарат системой идеальной фокусировки pi nano pizo stage, и оба гальванических O-образных и резонансных сканера уравновесят микроскопическую систему до тех пор, пока не будет достигнута желаемая температура. Перед получением изображения на основе показателя преломления среды визуализации по отношению к среде образца выберите подходящий объектив: воду, масло или воздух. Отрегулируйте корректирующее кольцо в соответствии с толщиной пластины.

Очистите объектив с помощью салфеток для объектива и этанола. Также очистите предметное стекло с образцом. Надежно поместите пластину на держатель предметного столика и проверьте устойчивость держателя образца, чтобы обеспечить правильные настройки для каждого образца.

Отрегулируйте корректирующий воротник с помощью флуоресцентных шариков, чтобы визуализировать функцию распределения точки с помощью глазного порта. Определите расположение и ориентацию дрожжей. Затем включите необходимую эпифлуоресцентную лампу и сосредоточьтесь на клетках, отображающих соответствующий фенотип.

Затем с помощью светлого поля оцените здоровье и жизнеспособность клеток в соответствии с формой и текстурой для оценки жизнеспособности клеток. Визуализируйте ядро с помощью TD томатной флоры Fluor, слитого с сигналом SV 40 и LS. TFP в два раза больше GFP.

Поскольку он находится выше предела диффузии ядра, он очень хорошо работает как ядерный маркер. Возбуждайте TFP с помощью зеленого лазера 4 88 нм одновременно с GFP, но собирайте зеленое и красное излучение в два отдельных PMT для получения спектрального разрешения. Чтобы свести к минимуму шум и насыщенность, отрегулируйте мощность лазера и диаметр точечного отверстия, как подробно описано в сопроводительной рукописи.

Если различные силы флоры излучают конгруэнтную длину волны, используйте функцию спектрального детектора, которая позволяет выбирать виртуальные фильтры для получения покадровых изображений в соответствии с экспериментальным планом, Misfolded Protein U BBC nine T предоставляет модельную систему для отслеживания контроля качества агрегации во времени и пространстве. В цитозоле при разрешающей температуре UBC 9 Ts сворачивается и диффундирует в ядре и цитозоле при неправильном сворачивании, вызванном теплом. Первоначально он образует быстро диффундирующие мелкие цитозольные агрегаты puncta, которые перерабатываются для протеасомной деградации.

Когда протеасома частично ингибируется, эти точки превращаются в мусор и включения iPod в течение примерно двух часов. В нормальных условиях девять T GFP UBC изначально свернуты и диффузно локализованы в цитозоле ядра, как видно здесь зеленым цветом. При изменении температуры до 37 градусов по Цельсию гибридный белок неправильно сворачивается и образует цитозольные пунктические агрегаты после восстановления после теплового шока при температуре 23 градуса Цельсия.

Термически денатурированное девять Ts G-F-P-U-B-C разрушается, о чем свидетельствует снижение уровня флуоресценции. Ядро помечено красным цветом N-L-S-T-F-P. Когда сдвиг температуры до 37 градусов по Цельсию сочетается с ингибированием протеасом, девять T G-F-P-U-B-C неправильно сворачиваются и перерабатываются в мусор и включения iPod.

Здесь убиквитиновая протеаза 4 чрезмерно экспрессируется для блокирования убиквитинации, ингибирование убиквитинации вместе с температурным сдвигом, что приводит к тому, что G-F-P-U-B-C девять T процессируются во включении iPod. Эти покадровые изображения, сделанные с интервалом в четыре минуты, ясно показывают динамику образования мусора и iPod. Этот метод может быть использован для мониторинга клеточного протеостаза с течением времени с использованием UBC nine T в качестве складного сенсора.

Четырехмерная визуализация также может быть выполнена в других модельных системах, таких как клетки млекопитающих и C elegance. Четырехмерная визуализация также позволяет получить представление о других тонких событиях в контроле качества агрегации, таких как образование и динамика растворимых очагов напряжения в заполнителях, а также доставка заполнителей в отсеки для мусора и iPod.