대상 - 에스테르 가수 분해 효소와 ER 칼슘의 직접 이미징 유발 염료 로딩 (TED)

다음 실험의 전반적인 목표는 살아있는 세포의 소포체 루멘 내에서 칼슘 역학을 직접 시각화하는 것입니다. 이는 세포에 targeted esterase induced dye(TED) 벡터 구조물을 형질전환하여 소포체 내에서 carbox esterase CS2를 과발현시킴으로써 달성됩니다. 그 다음, 세포를 아세토 메틸 에스테르 칼슘 지시약인 fluo-5 NAc와 함께 배양하며, 이 지시약은 세포막과 소포체 막을 통해 확산됩니다.

그 후 카르복실 에스테라제(carboxyl esterase)가 이를 분해합니다. 에스테르기가 소포체(er) 내강의 칼슘 민감성 지표를 방출시키고, 형광 칼슘 복합체가 형성됩니다.

생세포 이미징을 통해 소포체(ER) 내 유리 칼슘 농도의 변화를 보여주는 결과가 도출되었습니다. 이 방법은 세포 내 칼슘 항상성 조절에 관한 주요 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 칼슘 신호는 주로 세포질에서 모니터링되므로, 칼슘이 세포 외 공간에서 세포질로 유입되는지 아니면 세포 내 소포체 칼슘 저장고에서 유입되는지를 쉽게 구별할 수 없습니다.

이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 표적 에스테라제 유도 다운로딩(targeted esterase induced downloading) 방법을 개발했습니다. 이 방법을 통해 소포체(ER)에서 방출되는 칼슘을 직접적으로 모니터링할 수 있습니다. 이 접근 방식은 비파괴적입니다.

세포막은 온전하게 유지되며 세포 내 신호 전달 폭포는 보존됩니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인은 경험이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. TED Vector 발현에서, 우리는 Carboxylase CES two에 융합된 cent 단백질을 발현하는 벡터 구조물을 개발했습니다.

이를 통해 실험 중 AR 칼슘 이미징에 적합한 세포를 쉽게 식별할 수 있으며, 이러한 세포는 강한 적색 형광과 중간에서 강한 수준의 칼슘 지표 형광이 나타나는 것이 특징입니다. 이 형광 표지는 소포체 전체에 고르게 분포되어 있어야 하며 핵 영역에는 없어야 합니다. 시작하기 전에.

텍스트 프로토콜에 따라 인공 뇌척수액(A CSF)과 Fluoh5-NAM을 준비합니다. A CSF를 실온으로 예열하고 포도당을 첨가한 후, carbogen으로 5분 동안 에어레이션합니다. 그 다음, 염화칼슘과 염화마그네슘의 1 M 스톡 솔루션을 최종 농도가 각각 2 mM이 되도록 첨가합니다.

라이브 이미징 현미경과 컴퓨터 프로그램을 시작한 후, 더미 이미징 챔버에서 관류를 시작하여 튜브 시스템을 평형화하십시오. 인라인 용액 가열기와 현미경 스테이지 위의 이미징 챔버를 예열하고, 시스템을 32 to 37 °C로 평형화하십시오. 세포에 염료를 로딩하기 위한 다운로딩 절차를 시작하기 전에, 예열된 A CSF 100 µL를 5 mM fluo-5 NAM 0.5 µL 분주액 1개에 첨가하고, 워터배스에서 용액을 가용화한 후 90초 동안 초음파 처리하십시오. 예열된 이미징 용액 400 µL를 4-well 또는 24-well 플레이트의 웰 하나에 옮기십시오. 해당 웰에 D 용액을 첨가하여 5 µM 용액 500 µL를 제조하십시오.

다음으로, 세포가 부착된 커버슬립을 웰에 조심스럽게 넣고 37 °C의 세포 배양 인큐베이터에서 적절한 시간 동안 배양합니다. 로딩 시간과 D 농도는 세포 유형, 세포 밀도 및 실험의 특정 요구 사항에 따라 달라집니다. 배양 시간이 길어지면 세포, 특히 일차 뉴런 및 글리아 세포에 손상을 줄 수 있으며, 이는 생리적 자극에 대한 반응성에 결정적인 영향을 미칩니다. 30분 이상의 배양은 스파인(spine)의 MUEs와 같은 작은 마이크로 도메인 내 ER 칼슘 분포를 조사하기 위한 ER 칼슘 국소화 실험에만 유용합니다. 배양이 끝난 직후, 커버슬립을 이미징 솔루션이 들어 있는 다른 세포 배양 웰로 옮깁니다.

이미징 챔버에 세포를 마운팅하기 위해, 페인트 브러시를 사용하여 이미징 챔버에 고진공 그리스를 도포합니다. 저희는 소량의 부피를 갖는 10~12mm 커버슬립용 자체 제작 이미징 챔버를 사용하여, 분당 최대 15배의 버퍼 교환이라는 높은 관류 속도를 구현합니다. Flu oh five와 로딩된 세포가 있는 커버슬립을 집어 올린 후, 습윤 상태를 유지하기 위해 이미징 솔루션을 한 방울 떨어뜨립니다.

그런 다음 커버슬립을 뒤집어 세포를 이미징 챔버에 장착합니다. 면봉을 사용하여 커버슬립을 실리콘 접착제에 누르고, 유리 커버슬립 바닥에 남은 잔류 버퍼를 닦아냅니다. 다음으로, 더미 이미징 챔버를 실험용 이미징 챔버로 교체합니다.

세포 선택을 위해 연속 관류를 통해 5분에서 10분 동안 세포를 세척합니다. flu oh five 및 ER 내 calcium two의 급격한 광퇴색을 방지하기 위해 레이저 조사량을 최소화하고, 현미경 설정에서 2~4 Hz의 높은 스캔 속도, 작은 이미지 크기 및 높은 게인을 사용하십시오. 이는 식물 실험 조건에 따릅니다.

실험 시작 시, flu oh five 및 칼슘 표지와 red carbox cel esterase 컨스트럭트의 적색 형광 표지의 세포 내 분포를 기록하십시오. 관심 세포의 대표적인 뉴런을 고해상도 X, YZ 이미지 스택으로 촬영하여, 특정 실험 조건 하에서 ER 칼슘 역동성을 모니터링하기 위해 XYT 이미징을 수행하십시오. 시스템의 일반적인 설정은 텍스트 프로토콜의 표 2에 나열되어 있습니다. 이미징 솔루션으로 지속적으로 관류하며 ER 칼슘의 변화를 모니터링하십시오. 버퍼 교체 속도는 세포 세척 및 sarco endoplasmic reticulum calcium two ATPase 차단을 통한 저장고 고갈 시 1.5 milliliter per minute이며, ATP 및 metabotropic glutamate receptor의 작용제인 DHPG로 자극할 때는 3 milliliters per minute입니다.

여기서는 200 µM ATP로 10초 동안 글리아 세포를 자극합니다. 이미지를 처리하려면 다색 이미징용 Image J 프로그램에서 이미지 스택을 엽니다. 소프트웨어의 요청에 따라 RGB 채널을 분리하십시오.

관심 영역(ROI)을 지정합니다. 목적에 따라 소포체(ER) 전체 또는 소포체의 일부 작은 영역 주변으로 관심 영역을 설정합니다. time series analyzer 플러그인을 사용하여 관심 영역 내의 평균 픽셀 강도를 측정합니다.

이 공식을 사용하여 F zero 대비 delta F로 배경 보정된 형광 상대 변화량을 계산하십시오. 형광 상대 변화량을 Y축은 delta F over F zero, X축은 시간으로 하는 트레이스로 나타내십시오. 이 그림에서, A 세포인 피질 성상교세포와 해마 뉴런은 적색 형광 TED 벡터를 발현하며 저친화성 칼슘 지시약으로 표지되었습니다.

Fluo-5N. 형광 칼슘 지시약 복합체는 모든 세포 유형의 소포체에 국소화됩니다. 이 그림은 Fluo-5N으로 표지된 글리아 세포를 보여줍니다. CIN 처리 과정 중, CIN 처리 전후에 세포의 세포막이 손상된 경우 밝은 세포질 표지가 관찰됩니다.

이는 Fluo-5N이 내인성 에스테라아제(endogenous esterases)에 의해 세포질로도 방출됨을 보여줍니다. 이 실험에서는 Fluo-5N으로 TED 라벨링을 수행한 후, CIRCA 차단제인 cyclonic acid를 사용하여 배양된 해마 뉴런의 ER 칼슘 고갈을 유도합니다. 여기서 관찰되는 관심 영역(ROI)당 평균 형광 밀도의 엄청난 변화에 주목하십시오. 여기에는 ATP로 자극된 마우스 cortico GL 세포의 타임랩스 시리즈가 표시되어 있습니다. 형광이 갑자기 감소했다가 회복되는 것은 ER 칼슘의 방출과 재충전을 나타냅니다. 동시에, 광퇴색(photobleaching)의 결과로 적색 형광 단백질의 형광이 약간 감소합니다. 일부 실험(전체는 아님)에서 시간에 따른 형광 강도의 변화를 보여주는 도표가 제시됩니다.

일부 flu oh five N 복합체가 자극 과정 중에 손실되기 때문에 형광 값은 초기 형광 강도 수준으로 돌아가지 않습니다. 이 영상은 flu oh five N 칼슘 복합체로 표지하고 ATP로 자극한 carboxylase two 감염 BHK 21 세포를 고해상도로 보여줍니다. ATP로 유도된 칼슘 방출과 ER 칼슘 저장고의 재충전이 ER 세관의 미세 구조에서 시각화됨에 유의하십시오. 이 절차를 수행할 때, 완전히 건강한 세포만이 생리적 칼슘 반응을 보인다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

따라서 동일한 세포 배치를 사용하여 하루에 일련의 상호 연관된 칼슘 항상성 실험을 수행할 것을 권장합니다. 저희의 경험에 따르면, Fluo-5N 염료가 가장 효과적이지만, 이 칼슘 지표는 광퇴색에 매우 취약합니다. 그러므로 본 방법은 광퇴색에 더 강한 저친화성 칼슘 지표의 개발을 통해 더욱 개선될 수 있을 것입니다.

이 영상을 시청한 후, 합성 저친화성 칼슘 지시자를 사용하여 세포 외 칼슘 일시적 변화(calcium transient)를 이미지화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이러한 지시자를 사용하면 높은 시간 해상도로 세포 외 칼슘 역동성을 모니터링할 수 있습니다. 따라서 본 방법은 시냅스 가소성에 관여하는 칼슘 신호 전달 경로 연구 및 신경퇴행성 질환의 세포 모델에서 칼슘 항상성 변화를 모니터링하는 데 유용할 수 있습니다.