본 절차의 전반적인 목표는 아밀로이드 베타 독성이 신경세포의 기능과 생존에 미치는 영향을 평가하는 것입니다. 이를 위해 먼저 SE 감각 신경세포에서 GFP 리포터와 함께 아밀로이드 베타 펩타이드를 발현하는 형질전환 C elegance 벌레를 제작합니다. 그 다음, 화학주성 분석을 통해 SE 신경세포에서 아밀로이드 베타를 발현했을 때 나타나는 행동적 결과를 평가합니다.

세 번째 단계는 SE 뉴런의 일차 배양물을 얻은 다음, Q-V-D-O-P-H와 같은 약리학적 제제로 배양된 뉴런을 처리하여 아밀로이드 베타의 독성 효과를 억제하는 것입니다. 최종적으로, 행동 및 약리학적 분석을 통해 아밀로이드 베타 독성이 SE 뉴런의 기능과 생존에 미치는 영향을 확인할 수 있습니다. 이 방법은 특정 세포 및 분자 메커니즘을 규명하는 것과 같이 신경퇴행에 관한 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

아밀로이드 베타 올리고머의 잠재적인 신경독성 효과. 실험 절차 시연은 본 연구실의 박사후 연구원인 Dr.Zing Dwan이 진행합니다. 변형을 위해 2% agarose injection pad가 필요합니다. 물에 녹인 뜨거운 agarose 한 방울을 유리 커버슬립 위에 떨어뜨리고, 그 위에 빠르게 두 번째 커버슬립을 덮은 뒤 가볍게 두드립니다.

주입 혼합물을 만들 때, 반드시 원심분리 후 부유물과 기타 오염 물질이 없는 상층 5 µL를 새로운 튜브로 옮겨 주입 하중으로 사용하십시오. 주입 혼합물과 공벡터(empty plasmid)를 모세관 현상을 이용해 주입 피펫으로 흡입합니다. 보통 0.5 µL면 100마리의 벌레에게 주입하기에 충분합니다. 주입 피펫의 개구부를 넓히려면 Halo carbon 700 oil이 도포된 유리 슬라이드 위의 커버슬립 가장자리에 팁 끝을 문지르십시오. 개구부의 품질이 매우 중요합니다.

이는 팁의 모양으로 판단하며, 가장 중요한 것은 주입 압력에 반응하여 피펫 팁에서 형성되는 기포의 크기와 흐름으로 평가하는 유량입니다. 이제 주입 패드 위에 700 hallow carbon oil 한 방울을 떨어뜨리고 여러 마리의 벌레를 패드로 옮깁니다. 벌레 픽을 사용하여 벌레들이 아가로스에 부착될 때까지 패드 쪽으로 밀어 넣습니다.

벌레들은 복측이 정렬되도록 행을 맞추어 배치해야 합니다. 머리 부분을 건드리지 않도록 주의하십시오. 여러 번 시도한 후에도 벌레가 패드에 부착되지 않는 경우, 새 패드를 사용하거나 패드의 아가로스 두께 또는 농도를 높이십시오.

이제 피펫을 벌레에 삽입하십시오. 먼저, 스테이지를 이동시켜 벌레가 피펫 아래에 오도록 위치시킵니다. 그 다음, 피펫을 생식샘의 중앙핵 옆에 위치시킵니다.

세포질이 많은 생식 세포 핵에 의해 공유되기 때문에, 이는 주입된 DNA가 후대로 전달될 가능성을 높여줍니다. 피펫은 벌레와 거의 평행하게 놓여야 합니다. 셋째, 피부가 눌릴 때까지 팁을 몸체 쪽으로 수직으로 이동시킵니다.

마지막으로, 매니퓰레이터를 가볍게 두드려 팁을 삽입합니다. 이제 DNA 용액을 주입합니다. 생식낭이 부풀어 오를 때까지 피펫에 압력을 가합니다.

그런 다음 흐름을 멈추고 피펫에서 벌레를 떼어냅니다. 바늘의 흐름을 테스트한 후, 다음 벌레로 넘어가기 전에 다른 생식샘에 주입합니다. 주입 후, 벌레에 회복 완충액 약 10 µL를 첨가하고 벌레들이 헤엄치기 시작할 때까지 기다립니다.

웜이 헤엄치기 시작하면, 동일한 부피의 M nine 완충액을 추가합니다. 웜이 다시 헤엄치기 시작하면, 용액의 대부분이 M nine이 될 때까지 계속 추가합니다. 이제 각 웜을 시팅 플레이트로 옮깁니다.

50 mL falcon 튜브에 1 mL의 M9 버퍼를 넣고 GR 웜을 수집합니다. 그다음 M9 버퍼를 사용하여, 세척 후 M9 용액이 투명해질 때까지 원심분리와 용액 교체를 반복하여 웜을 세척합니다. 이어서, 웜에 10배 부피의 염기성 차아염소산염 용액을 첨가합니다.

펠렛화된 벌레들을 실온에서 약 5분의 4가 분해될 때까지 배양하며, 이는 보통 10분 정도 소요됩니다. 소량을 덜어 현미경으로 관찰하여 반응 상태를 확인하십시오. 동일한 부피의 멸균 egg buffer를 첨가하여 반응을 중단시킵니다.

그 후 450 G에서 5분 동안 원심분리하여 알과 사체를 수집합니다. 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 동일한 부피의 egg buffer를 다시 넣고 450 G에서 5분 동안 튜브를 다시 원심분리합니다.

완충액이 투명해질 때까지 이 과정을 반복합니다. 이제 알들을 M9 완충액에 넣고 하룻밤 동안 배양한 후, 다음 날 표준 NGM 플레이트에 접종합니다. 한 변의 길이가 약 0.5 cm인 한천 큐브를 여러 개 준비합니다.

원하는 유인제가 포함된 용액에 한천 덩어리를 2시간 동안 담가둡니다. 테스트 지점과 대조군 지점이 표시된 10cm 테스트 플레이트에 한천 덩어리를 배치합니다. 실험당 이러한 플레이트를 5개 준비합니다.

플레이트를 20 °C에서 하룻밤 동안 보관하여 화학적 구배가 형성되도록 합니다. 실험 전에 플레이트의 각 지점에 20 mM sodium azide 10 µL를 첨가합니다. 이는 마취제 역할을 합니다.

연령이 일치하는 벌레 20마리를 플레이트 중앙에 배치하여 실험을 시작하고, 플레이트를 20 °C 인큐베이터에 1시간 동안 둡니다. 1시간 후, 대조군 지점 대비 테스트 지점에 있는 개체 수를 세고 CI 지수를 계산합니다. 앞서 설명한 대로 gr 벌레를 용해하고 알과 사체를 세척한 후, 이를 2 mL의 멸균 알 버퍼에 다시 현탁하고 멸균된 60% sucrose 알 버퍼 2 mL를 추가합니다.

그런 다음 튜브를 손으로 섞거나 볼텍스(vortex)하여 알이 완전히 재현탁될 때까지 섞어줍니다. 재현탁된 알을 450 ×g에서 15분 동안 원심분리합니다. 그 후 알이 포함된 상층액을 조심스럽게 수집하고 잔류 수크로스를 제거하기 위해 펠렛(pellet)은 버립니다. 알을 알 버퍼(egg buffer)에 재현탁하고 450 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다.

상층액을 조심스럽게 수집하여 제거한 다음, 후드 내에서 세척 과정을 3회 반복합니다. 1 unit/mL의 chitinase가 포함된 멸균 egg buffer를 사용하여 침전된 알을 재부유시킵니다. 실온에서 30분 동안 알을 소화시킨 후, 도립 세포 배양 현미경으로 반응을 관찰하기 시작합니다.

난각의 70~80%가 소화되었을 때, 5 mL의 완전 L 15 배양액 또는 CM 15를 첨가합니다. 세포를 분리하기 위해, 27 gauge 바늘을 통해 세포를 몇 차례 통과시켜 세포가 뭉치지 않도록 해리합니다. 이제 이 용액을 5 µm 필터가 장착된 주사기로 통과시킵니다.

분리된 세포 현탁액을 450 G에서 15분 동안 원심분리하여 펠릿을 형성합니다. 그 다음 상층액을 제거하고 펠릿이 된 세포를 CM 15에 재현탁합니다. 세포가 완전히 분리되었는지 확인하기 위해 현미경으로 현탁액을 관찰합니다.

마지막으로, 분리된 세포를 이전에 코팅된 유리 커버슬립 위에 플레이팅합니다. 피넛 렉틴을 사용하면 세포를 상온의 일반 공기 상태에서 2주 이상 유지할 수 있습니다. 설명된 형질전환 기술을 사용하여, 화학주성 분석(chemotaxis assay)을 통해 biotin과 같은 수용성 유인 물질을 감지하는 a SE 뉴런에서 인간 a Beta 42를 발현하는 형질전환 웜을 제작하였습니다.

7일 된 형질전환 벌레를 대상으로 테스트를 진행하였습니다. 대조군은 비오틴을 찾는 데 어려움이 없었습니다. 반면, beta 42를 발현하는 벌레는 소수만이 유인제 지점을 찾을 수 있었습니다.

3~4일 차에 biotin의 화학주성 지수는 0.68이었으며, 대조군 및 실험군 웜의 지수는 각각 0.12였습니다. 또한 지수에서 작지만 감지 가능한 수준의 감소가 있었습니다. 생후 9일 차에도 여전히 GFP를 발현하고 있는 4일 차의 배양된 A SER 뉴런입니다.

하지만 GFP 형광이 사라졌으며, 이 가설을 검증하기 위해 세포 사멸(apoptosis)이 의심되었습니다. 기술된 대로 일차 A SER 뉴런을 준비하고 광범위 caspase 억제제를 첨가하였습니다. 예상대로, 이러한 처리는 형광 소실을 중단시켜 인간 A beta 42의 발현이 A SER 뉴런에서 세포 사멸을 유발한다는 것을 확인해주었습니다.

이 영상을 시청한 후에는 정교한 형질전환 웜을 제작하는 방법, 행동 분석 실험을 통해 이를 연구하는 방법, 그리고 Ambrose로부터 1차 배양물을 얻는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.