Name: 激光诱导的慢性高眼压表征视觉缺陷的小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 了解如何使用激光光凝小梁网建立小鼠慢性高眼压模型，并通过眼压计监测眼压变化，利用视动反应测试评估视敏度。该方法为研究高眼压对视功能的影响提供了可靠的实验模型。

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本论文所包含的工作得到了美国助医基金会青光眼研究道格拉斯·H·约翰逊奖（XL）、防盲研究会威廉与玛丽·格雷夫特殊学者奖（XL）、伊利诺伊州防盲协会（HC）以及美国国立卫生研究院资助项目R01EY019034（XL）的支持。

实验步骤
C57BL/6J 小鼠（Jackson Laboratory，缅因州巴港）在西北大学动物护理中心饲养。所有动物的使用均遵循西北大学机构动物护理和使用委员会批准的方案，并符合美国国立卫生研究院（NIH）《神经科学研究中动物使用指南》的规定。
1. 激光光凝术
激光光凝术的操作步骤是在先前已发表的方案基础上修改而成5-7。
<ol>
	<li>通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg，Butler Schein Animal Health，OH）和赛拉嗪（10 mg/kg，Lloyd Inc. of Iowa，Shenandoah，IA）对一只40至60日龄的小鼠进行麻醉。</li>
	<li>通过在实验动物右眼局部滴加一至两滴1%硫酸阿托品溶液（Alcon Labs, Inc.，Fort Worth，TX）以扩大瞳孔。</li>
	<li>散瞳后，压平前房以增强激光诱导效果6。在裂隙灯（SL-3E，Topcon，Oakland，NJ）下将带有锐利尖端的玻璃微移液管（World Precision Instruments Inc，Sarasota，FL）插入前房空间，排出前房内的液体。</li>
	<li>将小鼠固定于塑料锥形固定器（Braintree Sci Inc.，MA）中，并绑在自制平台上（见图1A）。用手握住固定器，使小鼠右眼朝向裂隙灯后方的光源。将麻醉后小鼠的右眼在裂隙灯下对准定位。</li>
	<li>双手持住小鼠固定器的同时，使用氩离子激光器（Ultima 2000SE，Coherent，Santa Clara，CA）对角膜缘进行激光照射。在小梁网周围垂直方向施加约80–100个激光点（514 nm，100 mW，50 msec脉冲，200 μm光斑）。C57BL/6小鼠具有色素性虹膜，可作为潜在散射能量的屏障7。</li>
	<li>在眼球表面局部滴加0.5%莫西沙星（Alcon Labs, Inc.，Fort Worth，TX）以消毒激光处理区域，并滴加0.5%丙帕卡因（Bausch &amp; Lomb，Rochester，NY）以缓解疼痛。</li>
	<li>将动物置于加热垫（Sunbeam Products Inc，Boca Raton，FL）上约一小时，直至其完全苏醒。</li>
	<li>左眼不做处理，作为对照。</li>
</ol>
2. 眼内压测量
<ol>
	<li>将清醒的小鼠放入管中，装入塑料锥形固定器，然后将其固定在平台上（见图2A）。</li>
	<li>让小鼠适应固定器位置5至10分钟。将回弹式眼压计（TonoLab，Colonial Medical Supply，Franconia，NH）移近小鼠眼睛，直至探针尖端距离角膜表面2-3 mm14。</li>
	<li>按下测量按钮，使探针尖端轻柔地接触角膜中心表面。对同一只眼睛连续进行三组各六次的眼压（IOP）测量，取平均值作为该眼的眼压值。未处理的对照眼始终先测量，以获得后续激光处理眼测量时的基线读数。</li>
</ol>
3. 视动反应测试
视敏度和对比敏感度通过14,15方法进行检测。通过反转漂移光栅的方向，分别检测小鼠的两只眼睛；即，使用顺时针漂移的光栅评估左眼的视觉功能，使用逆时针漂移的光栅评估右眼的视觉功能16。每次测试约需15分钟，并由两名观察者独立重复进行。
<ol>
	<li>将小鼠放置于一个由四台计算机显示器环绕的高架平台上，允许小鼠在平台上自由活动（图3A-B).</li>
	<li>将显示器设置为呈现水平移动的正弦光栅作为视觉刺激，其平均亮度为39 cd/m²。2光栅的移动方向应交替变化 顺时针和逆时针依次交替。</li>
	<li>分析动物的运动。在视觉刺激开启并逐渐增强后的15秒内，若动物的运动与漂移光栅同步，则视为“阳性”反应。能够引发最强反应的视觉刺激即定义为该动物的视敏度。 17.</li>
	<li>在三个预设的空间频率（0.075、0.16 和 0.3 周/度，cpd）下检测对比度敏感度。每只眼的对比度阈值定义为在预设频率下引发视觉反应的最低对比度。对比度敏感度为阈值的倒数。 17.</li>
</ol>

<ol><li>Gupta, N., Yucel, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glaucoma+as+a+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Glaucoma as a neurodegenerative disease.</a> Curr. Opin. Ophthalmol. 18, 110-114 (2007).</li>
<li>Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+death+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Neuronal death in glaucoma.</a> Prog. Retin. Eye Res. 18, 39-57 (1999).</li>
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<li>Grozdanic, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+mouse+model+of+chronic+ocular+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 44, 4337-4346 (2003).</li>
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<li>Ding, C., Wang, P., Tian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+general+anesthetics+on+IOP+in+elevated+IOP+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model.</a> Experimental Eye Research. 92, 512-520 (2011).</li>
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<li>Chiu, K., Chang, R., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+chronic+ocular+hypertension+model+on+SD+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser-induced chronic ocular hypertension model on SD rats.</a> J. Vis. Exp. (10), e549(2007).</li>
<li>Fu, C. T., Sretavan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+ocular+hypertension+in+albino+CD-1+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Laser-induced ocular hypertension in albino CD-1 mice.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 980-990 (2010).</li>
<li>Rangarajan, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+visual+deficits+in+aging+DBA%2F2J+mice+by+two+behavioral+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of visual deficits in aging DBA/2J mice by two behavioral assays.</a> Curr. Eye Res. 36, 481-491 (2011).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direction-specific+disruption+of+subcortical+visual+behavior+and+receptive+fields+in+mice+lacking+the+beta2+subunit+of+nicotinic+acetylcholine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direction-specific disruption of subcortical visual behavior and receptive fields in mice lacking the beta2 subunit of nicotinic acetylcholine receptor.</a> J. Neurosci. 29, 12909-12918 (2009).</li>
<li>Douglas, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+visual+threshold+measurements+in+the+two+eyes+of+freely+moving+rats+and+mice+using+a+virtual-reality+optokinetic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Independent visual threshold measurements in the two eyes of freely moving rats and mice using a virtual-reality optokinetic system.</a> Visual Neuroscience. 22, 677-684 (2005).</li>
<li>Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantification+of+adult+and+developing+mouse+spatial+vision+using+a+virtual+optomotor+system%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 4611-4616 (2004).</li>
<li>Morrison, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+model+of+chronic+pressure-induced+optic+nerve+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage.</a> Experimental Eye Research. 64, 85-96 (1997).</li>
<li>Cone, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+anesthesia%2C+mouse+strain+and+age+on+intraocular+pressure+and+an+improved+murine+model+of+experimental+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma.</a> Experimental Eye Research. 99, 27-35 (2012).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor+and+TrkB+modulate+visual+experience-dependent+refinement+of+neuronal+pathways+in+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor and TrkB modulate visual experience-dependent refinement of neuronal pathways in retina.</a> J. Neurosci. 27, 7256-7267 (2007).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neonatal+development+of+retinal+ganglion+cell+dendrites+by+neurotrophin-3+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Regulation of neonatal development of retinal ganglion cell dendrites by neurotrophin-3 overexpression.</a> The Journal of Comparative Neurology. 514, 449-458 (2009).</li>
<li>Sun, W., Li, N., He, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+morphological+survey+of+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Large-scale morphological survey of mouse retinal ganglion cells.</a> The Journal of Comparative Neurology. 451, 115-126 (2002).</li>
<li>Feng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+Ocular+Hypertension+Induces+Dendritic+Degeneration+of+Mouse+Retinal+Ganglion+Cells+that+Depends+on+Cell-type+and+Location%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Sustained Ocular Hypertension Induces Dendritic Degeneration of Mouse Retinal Ganglion Cells that Depends on Cell-type and Location.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. , (2013).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。
	作者是西北大学的全职雇员。
	作者未获得由生产本文所用试剂和仪器的公司提供的任何资助。

我们此前报道过，通过激光照射可在小鼠眼睛中诱导持续性的眼内压升高。与需要较高显微外科技术的生理盐水注射模型18和静脉烧灼模型11相比，激光照射方法相对简单且易于操作。通常我们可在2至3小时内完成4到6只小鼠的激光照射。实现持续性眼内压升高的关键步骤包括激光照射前的前房压平以及激光照射参数的设置。排出前房内的液体有助于将激光精准靶向至小梁网区域，并尽量减少对邻近睫状体和血管的损伤6。已有不同类型的激光被报道使用；例如，一些研究采用波长为532 nm的半导体激光5,6，而另一些研究则采用810 nm的能量脉冲7，以靶向角膜缘区域的小梁网和巩膜上静脉。为了最大程度地造成房角损伤，我们相较于先前报道的激光模型5-7增加了激光照射点的数量。在我们的实验条件下，几乎所有接受激光处理的小鼠在治疗后第一周内眼内压升高超过50%，其中约60%的小鼠眼内压升高持续超过2个月。相比之下，向小鼠眼内单次注射微珠仅能引起眼内压约30%的升高，持续数周时间8（另有研究提示眼内压升高的效应可能更持久9,1...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>moxifloxacin</td><td>Alcon Labs, Inc.</td><td>NDC 0065-4013-03</td><td>0.5%，仅限处方</td></tr><tr><td>盐酸丙帕卡因</td><td>博士伦</td><td>NDC 24208-730-06</td><td>0.5%，处方药</td></tr><tr><td>眼科用溶液USP</td><td>博士伦</td><td>NDC 24208-730-06</td><td>0.5%，仅限处方</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>巴特勒·施恩动物健康</td><td>NDC 11695-0550-1</td><td>100 mg / kg </td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>爱荷华州 LLOYD 公司</td><td>NADA 139-236</td><td>10 mg / kg </td></tr><tr><td>硫酸阿托品溶液</td><td>Alcon Labs, Inc.</td><td>NDC 61314-303-02</td><td>1%，仅限处方</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;仪器设备 &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>裂隙灯，TOPCON </td><td>Visual Systems Inc</td><td>SL-3E</td><td>由 PS-30A 驱动</td></tr><tr><td>OptoMotry 1.8.0 虚拟系统</td><td>CerebralMechanics 公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光动测试系统</td><td>CerebralMechanics 公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于小鼠的眼压计，TonoLab</td><td>Colonial Medical Supply</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Sunbeam Products Inc</td><td>722-810</td><td></td></tr><tr><td>氩离子激光器 </td><td>相干公司</td><td>Ultima 2000SE</td><td></td></tr><tr><td>DECAPICONE 塑料锥形瓶架 </td><td>Braintree Sci Inc.</td><td>MDC-200</td><td>用于小鼠</td></tr></tbody></table>

一种表征视觉缺陷的激光诱导小鼠慢性眼压升高模型

A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects

青光眼常与眼内压（IOP）升高相关，是导致失明的主要原因之一。我们旨在建立一种眼压升高小鼠模型，以模拟人类高眼压性青光眼。在此模型中，通过激光照射角膜缘，使房水流出通路发生光凝，从而诱导房角关闭。激光处理前后，使用回弹式眼压计监测IOP的变化。采用视觉运动反应行为学实验评估相应视觉功能的改变。文中展示了一只激光照射后出现持续性眼压升高的小鼠的代表性结果。该眼高压小鼠表现出视力和对比敏感度下降。综上所述，本研究建立了一个有价值的模型系统，可用于研究青光眼小鼠中神经元变性及其潜在的分子机制。

如实验步骤所述，激光照射的目标是角膜缘区域的巩膜静脉窦，以光凝阻塞房水流出通道，从而诱导房角关闭（图1）。大多数接受激光处理的眼睛未出现明显物理损伤、色素脱落或感染，这与既往研究结果一致6。当少数小鼠（少于所有激光处理动物的5%）出现严重损伤的体征，如眼球塌陷、严重白内障、明显色素脱落或出血时，我们立即实施了安乐死。约30%的激光处理眼睛出现了轻微角膜瘢痕，但大多数在激光治疗后1至2周内自行恢复。
在一百余只小鼠中，我们发现几乎所有经激光处理的眼睛均出现眼内压升高。实验动物的眼内压通过回弹式眼压计进行监测（图2）。图2B展示了一例激光处理前后眼内压变化的示例。在激光处理前，小鼠双眼的眼内压基线无显著差异：右眼为15.7 mmHg，左眼为14.7 mmHg（第0天，图2B）。激光处理7天后，经处理眼（右眼）的眼内压几乎升高至原来的2倍，达到30.7 mmHg，而未处理眼为15.7 mmHg。激光处理眼的眼内压在约4个月内持续维持...

采用激光光凝法对小鼠眼睛的房水引流系统进行处理，以诱导慢性高眼压。激光处理后，眼内压（IOP）可升高并持续数月。通过视觉运动反应测试监测实验动物的视力和对比敏感度下降情况。

青光眼常与眼内压（IOP）升高相关，是导致失明的主要原因之一。我们旨在建立一种小鼠模型……

本实验的总体目标是通过激光光凝小鼠小梁网组织，诱导慢性高眼压。在麻醉小鼠后，目标眼的瞳孔被充分散大，随后使前房变平。第二步是将激光束垂直于表面，沿小梁网周向照射，从而诱导眼压升高。接下来，使用眼压计随时间追踪小鼠的眼内压。最后一步是进行视功能检测，以显示视力的变化。最终，可随时间监测由高血压引起的视觉缺陷。在获得批准的I-A-C-U-C方案后，通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪，对一只40至60日龄的C57黑六小鼠进行麻醉。接着，仔细在左眼（对照眼）上涂抹眼膏，然后通过局部滴加一至两滴1%硫酸阿托品溶液，使右眼瞳孔散大。待瞳孔完全散大后，将一根锋利的玻璃微量移液管插入眼的前房空间，以排出前房内的液体。这将压平前房并增强激光诱导效果。然后将小鼠置于裂隙灯下，用塑料锥形固定器固定小鼠，并将其稳妥地安置在自制平台上。接下来，准备氩离子激光光源，将波长设为514纳米，功率设为100毫瓦，脉冲时长设为50毫秒，光斑大小设为200微米。激光准备就绪后，用固定器固定小鼠，将其右眼暴露于裂隙灯后方的光源下，以对准激光。随后使用氩激光将80至100个激光光斑垂直照射至角膜缘，围绕小梁网的整个周长进行照射。参见57只黑色六周龄小鼠。具有色素性虹膜，可作为屏障防止任何潜在的散射能量。操作完成后，在眼表滴加0.5%莫西沙星局部用药，以消毒激光处理区域，并使用0.5%丙胺卡因缓解疼痛。将动物置于加热垫上恢复约一小时，直至其完全清醒。将一只清醒的小鼠放入管中，然后将其装入塑料锥形固定器。接着，将小鼠固定在平台上。注意不要过度束缚小鼠，以免导致眼内压测量值人为升高。让小鼠适应固定位置 5 到 10 分钟。然后缓慢将回弹式眼压计移向对照眼，直至探针尖端距离角膜表面 2 至 3 毫米。应先测量未经处理的对照眼，以获得基线读数，再测量经激光处理的眼。将回弹式眼压计放置到位后，按下测量按钮，使探针尖端轻柔地接触角膜中心表面。对同一只眼睛连续进行三组测量，每组六次眼内压读数。每只眼睛的测量结果取平均值后，使用运动测试来检测视力和对比敏感度。首先将小鼠放置在一个由四个电脑显示器环绕的高架平台上，使其能够自由活动。设置视力检测装置的显示器，以呈现水平移动的正弦光栅作为视觉刺激，其平均亮度为每平方米39坎德拉。光栅的移动方向应在顺时针和逆时针之间连续交替。测试过程中，使用放置在小鼠上方的摄像机记录其运动。采用顺时针漂移光栅刺激评估左眼的视觉功能，采用逆时针漂移光栅刺激评估右眼的视觉功能。每次测试约需15分钟，由两名观察者独立重复进行，将与漂移光栅同步出现的运动视为阳性反应。若在刺激开始后15秒内出现反应，则在接下来的15秒内逐步增强视觉刺激，以确定引发最强反应的最高视觉刺激强度，以此评估动物的视敏度。随后，在三个预设的空间频率下检测每只动物的对比敏感度，将每只眼的对比敏感度阈值定义为在预设频率下仍能引发视觉反应

a-laser-induced-mouse-model-chronic-ocular-hypertension-to

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激光诱导的慢性高眼压表征视觉缺陷的小鼠模型

青光眼是全球主要的致盲原因之一。眼内压升高是其主要危险因素。激光光凝诱导的眼高压是已确立的动物模型之一。本视频演示了如何通过氩激光光凝在大鼠中诱导眼高压。...

SD大鼠激光诱导慢性高眼压模型

诱导大鼠模型中眼内压升高

本文介绍了小鼠激光诱导脉络膜新生血管（CNV）实验方案，该模型可重现新生血管性年龄相关性黄斑变性（AMD）的血管特征。掌握该技术后，可稳定有效地诱导CNV，作为测试多种实验干预措施的模型系统。...

一种用于激光诱导脉络膜新生血管形成的动物模型

本文介绍一种在小鼠眼球中诱导眼压升高的实验方案，该过程可导致视网膜神经节细胞丢失，类似于青光眼中所观察到的现象。将磁性微珠注射至前房，并利用磁铁将其吸引至虹膜角膜角，以阻塞房水的流出通道。...

一种利用磁性微珠阻塞模型诱导小鼠眼压依赖性青光眼的方法

此处，我们展示了纵向研究的实用性 体内 小鼠激光诱导脉络膜新生血管形态学改变随访中的成像...

体内 多模态成像与小鼠激光诱导脉络膜新生血管模型分析

通过在大鼠和小鼠中应用角膜缘环扎缝线诱导慢性眼压升高，导致视网膜神经节细胞出现与青光眼一致的功能性和结构性损伤。...

一种通过巩膜周缝合诱导大鼠和小鼠青光眼的模型

本文介绍了使用谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）在视网膜变性、青光眼、糖尿病性视网膜病变和近视等模型中活体可视化视网膜及眼部结构的方法。...

利用光学相干断层扫描对啮齿类动物模型中眼部疾病的体内结构评估

本文介绍了一种使用玫瑰红（rose...

视网膜静脉阻塞小鼠模型的优化以减少变异性的研究

光学相干断层扫描在小鼠视网膜病变模型中的应用

本实验方案的目的是表征一种基于360°热凝烧灼角膜缘血管丛以诱导亚急性眼内高压的青光眼神经变性新模型。...

啮齿类动物手术诱导青光眼的角膜缘血管丛全周电凝术

了解如何使用激光光凝小梁网建立小鼠慢性高眼压模型，并通过眼压计监测眼压变化，利用视动反应测试评估视敏度。该方法为研究高眼压对视功能的影响提供了可靠的实验模型。

一种表征视觉缺陷的激光诱导小鼠慢性眼压升高模型

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