Name: 人肝细胞通过一个两步胶原酶灌注过程隔离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: 学习使用两步胶原酶灌注法从人肝脏组织中分离高活性肝细胞的技术。该方法通过血管插管、胶原酶消化和低速离心等步骤，可获得适用于肝脏再生、药代动力学和毒理学研究的优质细胞。

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本研究得益于人体组织与细胞研究基金会，该基金会为科研提供了人体组织。本工作的经费由联邦教育与研究部（项目名称：虚拟肝脏网络，项目编号：0315759）和Hepacult有限公司提供支持。我们还要感谢格罗斯哈德恩医院组织库的技术助理采集肝脏样本，以及细胞分离核心设施的技术助理完成肝脏灌注和肝细胞分离工作。特别感谢Natalja Löwen在视频中演示了该实验操作。最后，我们感谢Natalja Löwen和Edeltraud Hanesch为图1及视频示意图中的各图绘制插图。

1. 灌注液与分离液的制备
<ol>
	<li>根据表1配制肝脏组织灌流和肝细胞分离所需的溶液。溶液可保存在4 °C直至使用。</li>
	<li>使用0.22 μm滤器对所有溶液进行无菌过滤。</li>
	<li>所有与肝脏接触的溶液均应保持无菌。</li>
</ol>
2. 灌注设备与溶液的准备
<ol>
	<li>肝脏组织灌注设备的安装应如图1所示。</li>
	<li>水浴温度应根据具体实验条件设定为适当温度，以确保溶液到达肝脏组织时温度为37 °C。本实验中，水浴设定为41 °C，用于加热溶液1、2、3以及夹套玻璃冷凝器。溶液4应于另一独立水浴中预热至37 °C后再使用，以减少胶原酶活性的损失。</li>
	<li>肝脏灌注开始前不久，打开装有95% O2/5% CO2混合气体的气瓶调节阀，向氧合装置通气（图1E）。</li>
</ol>
3. 肝脏灌注
<ol>
	<li>应从病理学家处获取一块尽可能保留完整格利森囊、理想情况下仅有一个切面的肝组织用于灌注。</li>
	<li>将该肝组织置于含有带孔滤膜的布氏漏斗中（图1B）。</li>
	<li>使用溶液1对灌注系统进行预冲。</li>
	<li>以低流速将带有橄榄状尖端的弯头灌注套管插入肝组织切面上较大的血管中。随着血液从肝脏中冲洗出来，在灌注良好的区域组织颜色会变浅。不同大小肝脏所使用的套管数量见图2A。所选套管规格应能紧密贴合血管，以确保套管固定到位。较小的血管应保持开放，以便灌注缓冲液从肝组织中流出。</li>
	<li>根据肝脏大小，将蠕动泵的流速提高至110–460 ml/min之间（图2B），平均每根套管流速为44±16 ml/min（图2C）。具体流速选择应根据肝组织情况而定，以使肝组织出现轻微膨胀为宜。在某些情况下，可能需要使用微血管夹闭合部分开放的血管，以实现上述轻微膨胀效果。当整个肝组织颜色明显变浅时，表明灌注效果良好。</li>
	<li>灌注过程中应用浸有生理盐水的纱布覆盖肝组织，以保持其湿润。</li>
	<li>用1 L溶液1进行灌注，以彻底冲洗出肝组织中残留的血液。</li>
	<li>更换灌注液为溶液2，继续灌注10分钟。</li>
	<li>切换灌注液为溶液3，灌注0.5 L。</li>
	<li>更换灌注液为含0.1–0.15%胶原酶的溶液4（表2）。</li>
	<li>此步骤应采用循环灌注方式持续9–12分钟，或直至肝脏消化充分；此时肝组织在格利森囊下应呈现轻微裂解，并在用手术刀钝端探查时感觉质地变软。</li>
</ol>
4. 肝细胞的分离
<ol>
	<li>关闭蠕动泵，并将导管从肝组织中取出。</li>
	<li>将肝组织放入含有 100–200 ml 溶液 5 的结晶皿中。</li>
	<li>小心去除格利森氏囊，并轻轻振荡以释放细胞。若存在灌注不良的区域，可使用手术刀切开这些区域，以释放其中的细胞。在操作过程中根据需要添加更多的溶液 5。</li>
	<li>继续添加溶液 5，直至总体积达到 500 ml。</li>
	<li>将细胞悬液过滤两次：首先通过 210 μm 尼龙筛网，然后通过 70 μm 尼龙筛网。接着，将细胞悬液倒入 200 ml 离心管中。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 72 g 离心 5 分钟。吸除上清液，并在 200 ml 溶液 5 中轻柔重悬细胞沉淀。</li>
	<li>重复步骤 4.6 的洗涤操作共三次。最后一次离心后，将细胞重悬于冷保存液中（见材料列表）。用于台盼蓝排斥法检测细胞得率和活力时，细胞浓度应约为每毫升 200 万至 500 万个肝细胞。</li>
	<li>进行台盼蓝排斥法检测时，取适量稀释的细胞悬液（约 200 万至 500 万个细胞/ml）0.1 ml，加入含有 0.5 ml 台盼蓝溶液（0.4% 台盼蓝溶于磷酸盐缓冲液（PBS））和 0.4 ml PBS 的微量离心管中。充分混匀细胞悬液后，取少量加载至血细胞计数板，在显微镜下以 100 倍放大观察。在显微镜下，死细胞被染成蓝色，而活细胞则未着色。计数血细胞计数板上每个 1 mm2 网格内的活细胞数和总细胞数。可通过以下公式计算细胞活力（%）、活细胞得率（每毫升冷保存液中的百万肝细胞数，或每克肝脏组织中的百万肝细胞数）。</li>
</ol>
<img alt="细胞活力与得率计算公式；肝细胞分析中肝细胞相关计算的方程式。" fo:src="/files/ftp_upload/50615/50615eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50615/50615eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 1"> 
注：本例中，台盼蓝稀释倍数为10，血细胞计数板校正因子为10,000。

<ol><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li>
<li>Schneider, W. C., Potter, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assay+of+animal+tissues+for+respiratory+enzymes+II.+Succinic+dehydrogenase+and+cytochrome+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The assay of animal tissues for respiratory enzymes II. Succinic dehydrogenase and cytochrome oxidase.</a> J. Biol. Chem. 149, 217-227 (1943).</li>
<li>Aubin, P. M. G., Bucher, N. L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Study+of+Binucleate+Cell+Counts+in+Resting+and+Regenerating+Rat+Liver+Employing+a+Mechanical+Method+for+the+Separation+of+Liver+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">A Study of Binucleate Cell Counts in Resting and Regenerating Rat Liver Employing a Mechanical Method for the Separation of Liver Cells.</a> Anat. Rec. 112, 797-809 (1952).</li>
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<li>Berry, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Properties+of+Cells+Isolated+from+Adult+Mouse+Liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic Properties of Cells Isolated from Adult Mouse Liver.</a> Journal of Cell Biology. 15, 1-8 (1962).</li>
<li>Laws, J. O., Stickland, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+Isolated+Liver+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolism of Isolated Liver Cells.</a> Nature. 178, 309-310 (1038).</li>
<li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells%3A+a+biochemical+and+fine+structural+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study.</a> The Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Rat-Liver+Cells+.3.+Enzymatic+Requirements+for+Tissue+Dispersion%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Preparation of Rat-Liver Cells .3. Enzymatic Requirements for Tissue Dispersion.</a> Experimental Cell Research. 82 (73), 391-398 (1973).</li>
<li>Thasler, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charitable+State-Controlled+Foundation+Human+Tissue+and+Cell+Research%3A+Ethic+and+Legal+Aspects+in+the+Supply+of+Surgically+Removed+Human+Tissue+For+Research+in+the+Academic+and+Commercial+Sector+in+Germany%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Banking%22%5BJournal%5D)">Charitable State-Controlled Foundation Human Tissue and Cell Research: Ethic and Legal Aspects in the Supply of Surgically Removed Human Tissue For Research in the Academic and Commercial Sector in Germany.</a> Cell and Tissue Banking. 4, 49-56 (2003).</li>
<li>Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+collagenases+on+the+isolation+of+viable+hepatocytes+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver.</a> Analytical Biochemistry. 138, 235-237 (1984).</li>
<li>Smedsrod, B., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Pure+Hepatocytes+and+Reticuloendothelial+Cells+in+High-Yield+from+a+Single-Rat+Liver+by+Means+of+Percoll+Centrifugation+and+Selective+Adherence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of Pure Hepatocytes and Reticuloendothelial Cells in High-Yield from a Single-Rat Liver by Means of Percoll Centrifugation and Selective Adherence.</a> J. Leukocyte Biol. 38, 213-230 (1985).</li>
<li>Cantrell, E., Bresnick, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzpyrene+Hydroxylase-Activity+in+Isolated+Parenchymal+and+Nonparenchymal+Cells+of+Rat-Liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Benzpyrene Hydroxylase-Activity in Isolated Parenchymal and Nonparenchymal Cells of Rat-Liver.</a> Journal of Cell Biology. 52, 316-321 (1972).</li>
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<li>Baccarani, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steatotic+versus+cirrhotic+livers+as+a+source+for+human+hepatocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+P%22%5BJournal%5D)">Steatotic versus cirrhotic livers as a source for human hepatocyte isolation.</a> Transplant P. 33, 664-665 (2001).</li>
<li>Renz, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+extended+donor+criteria+liver+allografts+maximizes+donor+use+and+patient+access+to+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Utilization of extended donor criteria liver allografts maximizes donor use and patient access to liver transplantation.</a> Annals of Surgery. 242, 556-563 (2005).</li>
<li>Schemmer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+donor+criteria+have+no+negative+impact+on+early+outcome+after+liver+transplantation%3A+a+single-center+multivariate+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Extended donor criteria have no negative impact on early outcome after liver transplantation: a single-center multivariate analysis.</a> Transplant Proc. 39, 529-534 (2007).</li>
<li>Alexandre, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+pre-%2C+intra-+and+post-operative+parameters+of+donor+liver+on+the+outcome+of+isolated+human+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Banking%22%5BJournal%5D)">Influence of pre-, intra- and post-operative parameters of donor liver on the outcome of isolated human hepatocytes.</a> Cell and Tissue Banking. 3, 223-233 (2002).</li>
<li>Spotnitz, W. D., Burks, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-of-the-art+review%3A+Hemostats%2C+sealants%2C+and+adhesives+II%3A+Update+as+well+as+how+and+when+to+use+the+components+of+the+surgical+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+applied+thrombosis%2Fhemostasis+%3A+official+journal+of+the+International+Academy+of+Clinical+and+Applied+Thrombosis%2FHemostasis%22%5BJournal%5D)">State-of-the-art review: Hemostats, sealants, and adhesives II: Update as well as how and when to use the components of the surgical toolbox.</a> Clinical and applied thrombosis/hemostasis : official journal of the International Academy of Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16, 497-514 (2010).</li>
<li>Spotnitz, W. D., Burks, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemostats%2C+sealants%2C+and+adhesives+III%3A+a+new+update+as+well+as+cost+and+regulatory+considerations+for+components+of+the+surgical+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Hemostats, sealants, and adhesives III: a new update as well as cost and regulatory considerations for components of the surgical toolbox.</a> Transfusion. 52, 2243-2255 (2012).</li>
<li>Toriumi, D. M., Raslan, W. F., Friedman, M., Tardy, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histotoxicity+of+cyanoacrylate+tissue+adhesives.+A+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+otolaryngology--head+%26+neck+surgery%22%5BJournal%5D)">Histotoxicity of cyanoacrylate tissue adhesives. A comparative study.</a> Archives of otolaryngology--head & neck surgery. 116, 546-550 (1990).</li>
<li>Vinters, H. V., Galil, K. A., Lundie, M. J., Kaufmann, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histotoxicity+of+cyanoacrylates.+A+selective+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroradiology%22%5BJournal%5D)">The histotoxicity of cyanoacrylates. A selective review.</a> Neuroradiology. 27, 279-291 (1985).</li>
<li>Bhogal, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+human+hepatocytes+from+normal+and+diseased+liver+tissue%3A+a+one+hundred+liver+experience%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary human hepatocytes from normal and diseased liver tissue: a one hundred liver experience.</a> PloS ONE. 6, e18222(2011).</li>
<li>Olson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concordance+of+the+toxicity+of+pharmaceuticals+in+humans+and+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Regul.+Toxicol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals.</a> Regul. Toxicol. Pharm. 32, 56-67 (2000).</li>
<li>Koebe, H. G., Pahernik, S. A., Sproede, M., Thasler, W. E., Schildberg, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+hepatocytes+from+slaughterhouse+organs.+An+unlimited+resource+for+bioartificial+liver+devices%5BTitle%5D)+AND+%22ASAIO+Journal%22%5BJournal%5D)">Porcine hepatocytes from slaughterhouse organs. An unlimited resource for bioartificial liver devices.</a> ASAIO Journal. 41, 189-193 (1995).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. , Methuen. (1959).</li>
</ol>

本方案的优化工作部分由Hepacult GmbH提供的资助支持。Wolfgang Thasler博士是Hepacult GmbH的创始人之一，并仍担任该公司董事会成员。Maresa Demmel的部分工作由Hepacult资助。Maria Hauner受雇于Hepacult GmbH。Hepacult是该大学衍生出的一家生物技术公司，提供经知情同意且开放获取的人肝细胞，用于科研目的。

本方案可分离获得高活力和高纯度的人肝细胞。为达到此效果，起始所用肝组织必须合适。肝组织应除一个切割面外，其余各表面均保留完整的格利森囊。另一个重要因素是所用胶原酶的批次，不同批次的胶原酶消化后所得肝细胞的活力可能存在显著差异11。因此，应预先测试不同批次的胶原酶，并大量获取能产生最高细胞活力的批次。最后，需根据所获细胞的产量和活力确定合适的消化时间。例如，高活力但低产量可能提示消化时间不足，而高产量但低活力则可能表明消化时间过长。
该方法可进行调整，以从同一块肝脏组织中分离出非实质细胞和肝细胞。一种方法是直接利用第一次离心步骤（步骤 4.6）后的上清液进行非实质细胞的分离12。另一种方法是在经尼龙网过滤后（步骤 4.5），取出用于肝细胞分离所需的细胞悬液等分试样，然后将剩余的细胞悬液进行额外的蛋白酶消化步骤，再进行非实质细胞分离，以提高非实质细胞的得率13。若希望以牺牲肝细胞产量为代价获得更高产量的非实质细胞，可对该方法进行修改：在步骤 3.10 中仅使用胶原酶而不使用蛋白酶和胶原酶联合消化，并将所得的细胞悬液用于非...

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/50615/isolation-human-hepatocytes-two-step-collagenase-perfusion">Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure </a>
The changes listed below have been made to Table 1.
1). In the recipe for Solution 2, the Final Concentration of EGTA has been changed from:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EGTA&#160;</td>
			<td>0.1mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
to:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EGTA&#160;</td>
			<td>1mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
2). In the recipes for Solution 3 and 4, the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate has been changed from:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Calcium chloride dihydrate&#160;</td>
			<td>0.5&#181;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
to:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Calcium chloride dihydrate&#160;</td>
			<td>5mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

A correction was made to: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure.
The Final Concentration of EGTA in Solution 2 and the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate in solutions 3 and 4 have been updated in Table 1.

Erratum: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

可通过机械法或酶解法从肝脏制备肝细胞悬液。用于制备完整肝细胞的机械法包括将肝脏强行挤压通过纱布 2，将肝组织块与玻璃珠在Kahn振荡器中振荡 3，使用带有松散研杵的玻璃匀浆器 4,5 等等。 多年来，机械法因会造成细胞膜损伤以及分离出的肝细胞功能丧失而逐渐不再受青睐 6,7因此，目前酶消化法是分离肝细胞的主要方法。
Berry 和 Friend8通过门静脉向大鼠肝脏灌注胶原酶和透明质酸酶，利用酶解法分离肝细胞，使该方法得到显著改进。这种灌注过程利用肝脏血管系统，使酶能够与大多数细胞密切接触，从而使肝细胞的得率提高了6倍8。此外，该方法获得的细胞保持了其结构完整性，内质网几乎未转化为游离囊泡，且无线粒体损伤8。
该方法由Seglen进行了改进1，他首创了一种两步灌注法用于肝细胞的分离。在此方法中，先用无Ca2+的缓冲液灌注大鼠肝脏，随后用含Ca2+的胶原酶缓冲液进行灌注1。第一步去除Ca2+有助于破坏桥粒结构，而第二步加入Ca2+则是胶原酶发挥最佳活性所必需的1,9。
鉴于上述已发表的研究工作均在大鼠中进行，本文旨在展示一种经过改进的操作流程，可用于从人肝脏中分离出高活力的肝细胞。使用人肝细胞对于转化医学研究以及验证基于动物模型的实验结果仍然具有重要意义。本研究中使用的人肝组织均通过人类组织与细胞研究基金会（Human Tissue and Cell Research Foundation）的伦理审批获取，该基金会为政府监管下的非营利性机构10。在病理学家取走用于诊断所需的组织后，从剩余组织中收集肝组织样本。病理学家所切取的组织为肝脏切除术后切除边缘的形态学上健康的组织。

<table><tbody><tr><td>气泡捕集器</td><td>Ga&amp;szlig;ner Glastechnik</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>玻璃夹套冷凝管</td><td>Ga&amp;szlig;ner Glastechnik</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>41 &amp;deg;C 水浴锅</td><td>Julabo</td><td>35723-H24/EG</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C 水浴锅</td><td>GFL</td><td>1083</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>压缩气体钢瓶（95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>Linde</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>透气性导管</td><td>Neolab</td><td>2-4440</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Ismatec</td><td>IP65</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Feather</td><td>320010</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Omnilab</td><td>5171014</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1 L 锥形瓶</td><td>Schott Duran</td><td>2121654</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>5 L 锥形瓶</td><td>Schott Duran</td><td>2121673</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>烧杯</td><td>Schott Duran</td><td>2110654</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>200 ml 离心管</td><td>Becton Dickinson</td><td>352075</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>结晶皿</td><td>Omnilab</td><td>5144063</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>带球头的弯头灌注套管</td><td>Ernst Kratz GmbH</td><td>1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>微血管夹</td><td>Ernst Kratz GmbH</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>B&amp;uuml;chner 漏斗</td><td>Carl Roth</td><td>HT38.1</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>210 &amp;mu;m 尼龙筛网</td><td>Neolab</td><td>4-1413</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 尼龙筛网</td><td>Neolab</td><td>4-1419</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m 无菌滤器</td><td>Peske</td><td>99505</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>500 ml 瓶</td><td>Schott Duran</td><td>2180144</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1 L 瓶</td><td>Schott Duran</td><td>2180154</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Peske</td><td>06-0001</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1.5 ml 管</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120,086</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>50 ml 锥形管</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>冰桶</td><td>Neolab</td><td>1508454</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>无菌巴斯德移液管</td><td>Brand</td><td>747715</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>电动移液器（Pipette boy acu）</td><td>Integra</td><td>155017</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>制冷离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>层流柜</td><td>Kendro</td><td>Hera safe-KS9</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>吸引器（低流量手术抽吸泵）</td><td>Atmos</td><td>C361</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>实验室燃气灯</td><td>Integra</td><td>Fire Boy eco</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>一次性实验服</td><td>Paperlynen GmbH</td><td>MD0202414</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>带面罩的外科口罩</td><td>Kimberly-Clark</td><td>48247</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>外科头罩</td><td>Barrier</td><td>42072</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乳胶手套</td><td>Semper Care</td><td>CE0321</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胶原酶（批号 NB 4G）</td><td>Serva</td><td>17465</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Merck</td><td>2382</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Roth</td><td>9265.2</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Roth</td><td>9105.3</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Serva</td><td>26868</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>白蛋白</td><td>Biomol</td><td>01400-2</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Serva</td><td>22700</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Serva</td><td>30180</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>冷保存液</td><td>Hepacult GmbH</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

通过两步胶原酶灌注法分离人肝细胞

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

肝脏是一种具有卓越再生能力的器官，执行多种功能，如解毒、代谢和维持内环境稳定。因此，肝细胞是大量研究问题的重要模型。特别是人肝细胞在药代动力学、毒理学、肝脏再生及转化医学研究领域尤为重要。本方法介绍了一种改良的两步胶原酶灌注法，用于分离肝细胞，该方法由 Seglen 1 首次描述。
既往，肝细胞的分离主要采用机械法。然而，研究表明酶消化法更具优势，因为分离后的肝细胞能够保持其结构完整性和功能。本文所述方法借鉴了先前用于大鼠肝脏的分离技术，并将其改进应用于人肝组织，可获得大量活性达77±10%的肝细胞。该方法的主要差异在于血管插管的操作过程。此外，本方法也可推广应用于其他物种的肝脏，只要其肝脏或血管尺寸与人肝相近即可。

灌注装置设置
应根据图1设置肝脏灌注所需的设备。
人肝细胞分离后的存活率与得率
分离的人肝细胞平均存活率为77±10%，肝细胞平均得率为13±11×10⁶个肝细胞/克肝脏，数值以均值±标准差表示。获得上述平均值所依据的肝细胞分离实验共648次，时间为1999年1月至2012年12月。
合适的灌注参数
为了成功完成肝脏的灌注和冲洗，所使用的套管数量应根据肝脏的重量进行调整（图2A）。一般来说，对于重量在20 g以下至80 g以上的肝脏，应使用4-8根套管。应根据肝脏重量选择合适的灌注速率，以实现成功的肝脏灌注（图2B 和 C）。研究发现，平均灌注速度为 44 ml/min 的导管-1 适用于不同肝脏重量，因此若使用更多导管，应...

本文描述了一种改良的两步胶原酶灌注法，用于分离人肝细胞。该方法也可应用于其他哺乳动物肝脏。所获得的肝细胞产量高、活性好，是肝脏再生、药代动力学和毒理学等科学研究领域的理想模型。

肝脏是一种具有卓越再生能力的器官，执行多种功能，如解毒、代谢和维持内环境稳态。

本实验的总体目标是通过两步胶原酶灌注法分离人肝细胞。首先，使用灌注套管对肝组织中的血管进行插管，随后利用胶原酶对肝组织进行灌注和消化。第三步是去除光泽膜囊，从而释放解离的肝细胞。最后一步是低速离心，以分离肝细胞。最终，可通过相差显微镜观察肝细胞，或通过免疫细胞化学法进行白蛋白染色来鉴定肝细胞，细胞活力和得率则通过台盼蓝排斥实验测定。该方法的可视化演示至关重要，因为插管和消化步骤较难掌握。这是因为插管需要一定的技巧，而判断消化是否完成也较为困难。对于初次接触该技术的人员，本实验操作将由我实验室的技术员 Natalie Lun 进行演示。在本演示中，我们将使用一段灯鱼肝脏来代替人肝组织。按照以下方式设置肝脏组织灌流所需的设备：调节水浴温度，使溶液到达肝脏组织时保持在37摄氏度。溶液一、二、三的适宜温度为41摄氏度，而用于夹套式玻璃冷凝器的溶液四则应保持在37摄氏度，以减少胶原酶活性的损失。在灌流开始前不久，打开供氧装置的气体调节阀。从病理学家处获取一段肝脏组织，理想情况下应具有大部分或完全完整的格利森囊，且仅有一个切割面。将含有带孔滤膜的布氏漏斗上的肝组织块，需使用低流速灌注系统进行预灌注。具体操作为：将带有橄榄形头端的弯曲灌注套管插入肝组织切面较大的血管中，并用溶液一进行灌注。随着血液从肝脏中被冲洗出来，灌注充分的区域组织颜色会逐渐变浅。根据肝脏大小不同，所使用的套管数量也有所差异。通常，对于重量在20克以下至80克以上的肝脏，应使用四到八根套管。选择套管的规格时，应确保其与血管紧密且牢固贴合。保留较小的血管开放，以便缓冲液从组织中排出。现在，将蠕动泵的流速提高至每分钟 110 至 460 毫升。在整个流速范围内，若肝组织呈现较浅的颜色，则表明灌注效果良好。灌注速率应根据肝组织的大小进行调整，较大的肝脏需使用较高的灌注速率。一般来说，对于不同重量的肝脏，每根插管以每分钟 44 毫升的平均灌注速度为宜。所选择的流速应使肝组织略微膨胀。灌注过程中用浸有生理盐水的纱布覆盖肝组织，以保持其湿润。用一升溶液灌注组织，以冲洗掉肝组织中残留的血液。将灌注液更换为溶液二，继续灌注10分钟。随后，将灌注液更换为溶液三，用半升溶液进行灌注。 现在将灌注液更换为含有胶原酶的溶液四。以循环灌注方式持续灌注9至12分钟，或直至肝脏组织消化充分。在有光泽的包膜下，肝组织应呈现轻微破裂分离的状态。用手术刀的钝端探查时，肝脏也应感觉质地变软。肝组织块的消化时间必须恰当，因为消化过度会导致肝细胞活力降低，而消化不足则会导致肝细胞产量减少。首先关闭蠕动泵，并将套管从肝组织块上移除。然后将组织放入含有100至200毫升溶液的结晶皿中。五、小心地去除光泽囊膜，并轻轻振荡以释放细胞。如果存在灌注不良的区域，可使用手术刀切开这些区域，以释放其中的细胞。在操作过程中根据需要添加更多溶液五，最终将溶液五的体积补至 500 毫升。现在将细胞悬液过滤两次。首先，将细胞通过 210 微米的尼龙滤网过滤至一个 1 升的锥形瓶中。然后将细胞通过70微米的尼龙滤网过滤至一个1升的锥形瓶中。将细胞悬液均分为两份，分别倒入200毫升离心管中。随后在4摄氏度条件下，以72 ×g离心5分钟。吸出上清液，并在细胞沉淀中加入约200毫升溶液，轻轻重悬。重复离心和重悬步骤三次。最后一次离心后，将细胞重悬于冷保存液中，最终浓度为每毫升200万至500万个肝细胞。可使用台盼蓝染色法结合血细胞计数板准确测定细胞数量。图中显示了来自 648 次分离的台盼蓝染色肝细胞。分离的人肝细胞平均活力为 77 ± 10%。通过免疫荧光法测定，肝细胞的平均得率为每克肝脏 13 ± 11 × 10⁶ 个肝细胞。通过绿色荧光标记白蛋白阳性染色确定肝细胞纯度，纯度为 94 ± 1%。免疫荧光染色进行了四次，每次试验包含五个重复样本。相差显微镜显示了肝细胞的形态学特征，例如其较大的细胞体积和多边形形状。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用两步胶原酶灌注法分离人肝细胞。

isolation-human-hepatocytes-two-step-collagenase-perfusion

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

人肝细胞通过一个两步胶原酶灌注过程隔离

肝窦内皮细胞（SECs）的研究必须使用从动物体内获取的原代细胞进行，因为目前尚无可用的细胞系。该方法依赖于肝脏消化和差速离心法来纯化SECs，以便后续培养和实验操作。...

体内 肝脏内吞作用的观察及通过肝脏灌注纯化肝细胞

一种从大鼠肝脏分离门静脉成纤维细胞的技术。肝脏经灌注并消化处理 原位 用胶原酶处理，随后 离体...

大鼠门静脉成纤维细胞的分离 原位 肝脏灌注

本文描述了一种从同一供体分离人类肝细胞和非实质肝脏细胞的技术。不同类型的肝脏细胞构成了功能性肝脏模型和组织工程的基础。该新方法旨在以高得率和高活性分离肝脏细胞。...

原代人肝细胞及其主要非实质肝细胞群的分离方案

本实验方案的目的是从肝脏中获得高活力和高产量的肝细胞及肝窦内皮细胞。通过门静脉灌注IV型胶原酶溶液，随后进行差速离心，从而分离得到肝细胞和肝窦内皮细胞。...

小鼠肝脏灌注法分离肝细胞和肝窦内皮细胞

本方案用于从肝脏中分离组织来源的细胞外囊泡（EVs）。该方案描述了一个两步法流程，包括先进行胶原酶灌注，再通过差速超速离心，以分离肝脏组织中的细胞外囊泡。...

从肝脏中分离组织细胞外囊泡

本文介绍了一种利用改良的胶原酶灌注技术从成年小鼠肝脏中分离小鼠肝细胞的实验方案。同时描述了在三维胶原三明治结构中对肝细胞进行长期培养的方法，以及对细胞骨架成分进行免疫标记，以研究胆小管的形成及其对处理的响应。...

分离与三维胶原三明治培养原代小鼠肝细胞以研究细胞骨架在体外胆小管形成中的作用

本方案详细介绍了使用特殊静脉导管、标准化的一次性无菌管路、结合实时监测的温度控制以及报警系统，进行两步胶原酶灌注，以提高分离的原代大鼠肝细胞的活力、得率和功能的一致性。...

通过多参数灌注控制分离大鼠原代肝细胞

脂肪酸β-氧化是一种重要的代谢途径，在包括肝细胞在内的多种细胞类型中负责能量生成。本文介绍一种利用14C标记的棕榈酸测定 freshly isolated primary...

新鲜分离小鼠肝细胞悬液中脂肪酸β-氧化的测定

本文概述并演示了一种分离小鼠原代肝窦内皮细胞（LSEC）的实验方案。该方案基于肝脏胶原酶灌注、通过低速离心法纯化非实质细胞以及CD146磁珠分选技术。我们还利用流式细胞术和扫描电子显微镜对分离得到的LSECs进行表型鉴定与特征分析。...

小鼠原代肝窦内皮细胞的分离与鉴定

富含脂质的肝细胞在肝脏再生过程中具有内在作用，但通常在密度梯度离心过程中丢失。本文介绍了一种优化的细胞分离方案，可保留脂肪变性肝细胞，从而在小鼠部分肝切除术后获得具有代表性的再生肝细胞群体。...

小鼠部分肝切除术后再生肝细胞的分离

本方案介绍了一种在大鼠模型中优化的两步胶原酶肝脏灌注技术，并展示了分离肝细胞的应用 体外...

大鼠肝脏灌注与原代肝细胞分离：一种对前沿3D类器官培养至关重要的传统方法

学习使用两步胶原酶灌注法从人肝脏组织中分离高活性肝细胞的技术。该方法通过血管插管、胶原酶消化和低速离心等步骤，可获得适用于肝脏再生、药代动力学和毒理学研究的优质细胞。

通过两步胶原酶灌注法分离人肝细胞

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