Name: Les analyses de viabilité de cellules en culture (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Découvrez les tests de viabilité cellulaire combinant mesure d'ATP, immunomarquage et imagerie infrarouge pour évaluer la santé cellulaire. Cette méthode offre une analyse objective de l'intégrité structurale et métabolique.

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Nous reconnaissons Juliann Jaumotte à l&#39;idée d&#39;économiser sur les volumes de réactifs dans le dosage de l&#39;ATP. Nous sommes profondément reconnaissants pour le soutien administratif superbe de Marie Caruso, Deb Willson, et Jackie Farrer et à l&#39;École de pharmacie de Mylan pour fournir un soutien financier pour ces études. Merci aussi aux maladies Hunkele redouté Fondation et le Parkinson et les troubles du mouvement de la Fondation pour le soutien financier des études primaires de neurones.

Aucun des auteurs n&#39;a de conflit de divulguer.

Nous avons trouvé que la puissance du signal dans les trois essais de viabilité est linéaire et en corrélation avec la densité de placage. Cependant, tous les tests sont également sensibles à 2 fois ou 1,5 fois les changements dans la densité de placage. Pour les cellules N2a, les analyses infrarouges sont moins sensibles que le dosage de l&#39;ATP, en particulier à des densités de plaquage inférieure. Bien que les analyses infrarouges sont moins sensibles que l&#39;ATP, les DRAQ5 + Sapphire tests et les essais α-tubuli...

Le test de viabilité la plus courante dans les sciences biologiques implique nombre de cellules. Ceci est démontré par une analyse des meilleurs (les plus récents) de 200 publications parues dans PubMed avec l&#39;un des mots-clés «in vitro» ou «culture» sur 29/04/2013 et 30/04/2013. Parmi ces publications, 23,5% utilisés essais de comptage de cellules, y compris les manuels nombre de cellules chiffres, le nombre de cellules automatisé compte avec un logiciel d&#39;imagerie, et exclusion au bleu Trypan. Le dosage Vivant / Mort a été utilisé dans 1% de ces publications. Le nombre de publications utilisant le MTT (3 - (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényl) test pour la viabilité métabolique était de 11%. Cette revue de la littérature montre également que le nombre de publications en utilisant des tests tels que MTT en conjonction avec les tests de comptage cellulaire n&#39;était que de 3,5%. Malgré la tendance à utiliser un test de viabilité par lui-même, l&#39;évaluation de la fonction cellulaire en combinaison avec le nombre de cellules semble le meilleur choix pour l&#39;évaluation i cellulaireNtegrity. Les comptages cellulaires par eux-mêmes ne sont pas suffisants parce que les cellules restantes ne peuvent pas être fonctionnel ou en bonne santé, même si elles sont présentes dans le puits de 1,2. A l&#39;inverse, les mesures fonctionnelles telles que l&#39;ATP peut augmenter ou diminuer en l&#39;absence de changements parallèles dans le nombre de cellules. Le découplage de lectures métaboliques du nombre de cellules suggère que l&#39;ATP et MTT essais ne doivent jamais être utilisés comme seul test de viabilité. Dans le présent rapport, trois essais de viabilité, qui sondent les structures cellulaires et la fonction métabolique sont décrits, pour une vision plus globale de l&#39;intégrité cellulaire que n&#39;importe quel test en lui-même ne peut se permettre. Deux de nos tests nécessitent un imageur infrarouge qui mesure la fluorescence dans les canaux 700 et 800 nm. Le bruit est faible dans les longueurs d&#39;onde infrarouges, entraînant une hausse des signal-bruit ratios 3. L&#39;imageur de l&#39;Odyssée que nous utilisons a une gamme dynamique de 4,5 log et une profondeur de bits de 16, Translating à 2 16 ou 65 536 nuances de l&#39;infrarouge. Cela peut être comparé à l&#39;imagerie de couleur 8 bits, qui ne donne 2 8 ou 256 nuances de couleur pour chaque longueur d&#39;onde. Ainsi, l&#39;imagerie 16 bits a une résolution plus fine. Il convient de noter que les images infrarouges d&#39;origine sont souvent pseudocolored vert (800 nm) et le rouge (700 nm) dans des rapports publiés pour la présentation. imageurs Odyssey sont couramment utilisés à la fois pour Western blot et In-Cell Westerns 4-7. In-Cell Westerns sur les cellules fixées au formaldehyde utilisent des anticorps primaires contre toute protéine d&#39;intérêt et de les étiqueter à son tour avec des anticorps secondaires fluorescents infrarouges. Cette technique est connue pour être particulièrement utile pour les points d&#39;extrémité de phosphorylation 6. Dans notre In-Cell Westerns, nous colorer les cellules fixes de protéines du cytosquelette α-tubuline ou aux microtubules neuronaux de la protéine associée à 2 (MAP2) dans le canal de 800 nm. Ces protéines sont assez abondantes pour donner rapports signal sur bruit. Nous tachons également nos assiettes dans le 700canal nm pour les noyaux avec la tache de DRAQ5 et pour le cytoplasme avec la tache de Sapphire. Tant les protéines du cytosquelette et les DRAQ5 + taches Sapphire reflètent donc des structures cellulaires. Le troisième test de viabilité de mesurer la fonction métabolique et est appelé &quot;Cell Titer Glo.&quot; Pour ce dosage à base de luciférase-, valeurs de luminescence sont en proportion directe avec les taux d&#39;ATP. Essais ATP sont couramment utilisés pour quantifier les cellules viables 8-12. Cependant, y compris le mot «titre» dans le nom de l&#39;analyse est un peu un abus de langage car la production d&#39;ATP par cellule peut changer en fonction des traitements de toxine et n&#39;est donc pas toujours en proportion du nombre de cellules 8. Les niveaux d&#39;ATP peuvent également être affectés par les rythmes circadiens 13 et par la division cellulaire 14 et la différenciation des cellules 15. Néanmoins, le dosage de l&#39;ATP montré ici est simple à réaliser et utile car l&#39;ATP est une mesure robuste métaboliqueviabilité 16-21, sinon la cellule numéro en soi. L&#39;utilisation de ce test pour compléter l&#39;infrarouge In-Cell Westerns cède donc une image plus complète de l&#39;intégrité cellulaire que tout un test seul.

<table><tbody><tr><td>Cell Titer Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td>Achetez en quantités de 100 ml et aliquote, au lieu d’acheter la quantité plus chère de 10 ml. Les réactifs reconstitués et non utilisés peuvent être recongelés à -20 &deg ; C pendant au moins 21 semaines</td></tr><tr><td>18 % Formalin</td><td>Thermo-Shandon</td><td>9990244</td><td>L’achat de ce fixateur évite la pesée des poudres de formaldéhyde et l’ébullition de la solution ; l’exposition aux vapeurs est ainsi minimisée</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>Il n’est pas essentiel de l’ajouter aux solutions de formaldéhyde, mais cela améliore l’apparence des cellules fixées</td></tr><tr><td>Odyssey Block</td><td>LI-COR</td><td>927-40003</td><td>Ce sérum de poisson peut être acheté en vrac et congelé à -20 &deg ; C pour une utilisation à long terme</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21568</td><td>Nous stockons une solution mère de 10 % de Triton-X 100 dans de l’eau stérile à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique</td><td>Fisher</td><td>S468</td><td>On peut également acheter des comprimés PBS ou des solutions 10x PBS, mais ils sont plus chers</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique</td><td>Fisher</td><td>S373</td><td>Voir ci-dessus</td></tr><tr><td>Azoture de sodium (250x)</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>7144.8-16</td><td>N’achetez pas la poudre car l’azoture de sodium est très toxique. Nous stockons tous nos anticorps utilisés dans 1x azoture de sodium à 4 &deg ; C jusqu’à ce qu’ils soient contaminés par des débris</td></tr><tr><td>Souris anti-&alpha ;-tubuline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5168</td><td>Cet anticorps est coûteux mais peut être considérablement dilué et est très spécifique</td></tr><tr><td>Souris anti-MAP2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9942</td><td>Cet anticorps est coûteux mais est très spécifique (une condition préalable pour les westerns en cellule)</td></tr><tr><td>800 nm Chèvre anti-souris IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-32210</td><td>D’autres sociétés vendent également des anticorps secondaires infrarouges. Assurez-vous d’acheter les anticorps hautement adsorbés et notez que les concentrations d’IgG peuvent varier avec la source</td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Biostatus</td><td>DR50200</td><td>Ce composé était vendu par LI-COR à 1 mM</td></tr><tr><td>Sapphire</td><td>LI-COR</td><td>928-40022</td><td></td></tr><tr><td>Luminomètre</td><td>PerkinElmer</td><td>VICTOR3 1420 compteur</td><td></td>multi-étiquettes</tr><tr><td>Odyssey Imager</td><td>LI-COR</td><td>9201-01</td><td></td></tr><tr>Produits <td>de recherche</td> sur les<td>agitateurs/mélangeurs</td><td>248555</td><td></td></tr></tbody></table>

les analyses de viabilité de cellules en culture

Viability Assays for Cells in Culture

Le nombre de cellules manuelles sur un microscope sont des moyens sensibles à l&#39;évaluation de la viabilité cellulaire, mais prennent du temps et par conséquent coûteux. Essais de viabilité informatiques sont coûteux en termes d&#39;équipement, mais peut être plus rapide et plus objective que les comptages manuels cellulaires. Le présent rapport décrit l&#39;utilisation de ces trois essais de viabilité. Deux de ces dosages sont l&#39;infrarouge et l&#39;autre est luminescent. Les deux tests infrarouges reposent sur un imageur 16 bits Odyssey. Une analyse infrarouge utilise la tache de DRAQ5 pour les noyaux combinés avec la tache de Sapphire pour cytosol et est visualisé dans le canal 700 nm. L&#39;autre test infrarouge, un In-Cell occidentale, utilise des anticorps contre les protéines du cytosquelette (α-tubuline ou microtubules protéines associées 2) et les étiquettes dans le canal 800 nm. Le troisième test de viabilité est un dosage luminescent couramment utilisé pour l&#39;ATP, mais nous utilisons un quart de la quantité recommandée pour économiser sur les coûts. Ces mesures sont toutes linéaires et sont en corrélation avec le nombre de CElls plaqué, mais varient en sensibilité. Tous les trois essais contourner microscopie temps et déguster l&#39;ensemble bien, ce qui réduit l&#39;erreur d&#39;échantillonnage. Enfin, tous les tests peuvent facilement être achevée dans un délai d&#39;une journée de la fin de l&#39;expérience, ce qui permet un plus grand nombre d&#39;expériences à réaliser dans des délais courts. Cependant, elles reposent toutes sur l&#39;hypothèse que le nombre de cellules restent en proportion de la force du signal après les traitements, une hypothèse qui est parfois pas satisfaite, en particulier pour l&#39;ATP cellulaire. En outre, si les cellules augmentent ou diminuent en taille après le traitement, cela pourrait affecter la force du signal sans affecter le nombre de cellules. Nous concluons que tous les tests de viabilité, y compris les comptages manuels, souffrent d&#39;un certain nombre de réserves, mais que les essais de viabilité informatisés valent bien l&#39;investissement initial. En utilisant les trois dosages donne ainsi une vue d&#39;ensemble de la structure et de la fonction cellulaire.

Le facteur limitant la vitesse dans ces expériences est la coloration de l&#39;infrarouge, comme le dosage de l&#39;ATP est relativement courte en durée. Pour les tests infrarouges, nous prévoyons que huit plaques à 96 puits peuvent être colorés et analysés dans un jour par échelonnement deux lots de quatre assiettes maximum (voir la figure 1). Cette estimation suppose 20 min de fixation, 30 min de lavage, 30 min de blocage, 2 h primaire incubation d&#39;anticorps puis 30 min de lavages, 1 heure d&#39;i...

Les composés thérapeutiques sont souvent d&#39;abord examiné in vitro par des tests de viabilité. Le nombre de cellules aveugles par un observateur humain peuvent être très sensibles à de faibles variations du nombre de cellules mais ne pas évaluer la fonction. Essais de viabilité informatiques, tel que décrit ici, peuvent évaluer à la fois la structure et la fonction d&#39;une manière objective.

Les analyses de viabilité de cellules en culture

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

L'objectif général de cette procédure est de réaliser plusieurs tests de viabilité qui offrent une vision plus complète de la capacité cellulaire que ne pourrait en fournir un seul test pris isolément. Cela est réalisé en mesurant d'abord les niveaux d'ATP des cellules en culture afin d'évaluer leur fonction métabolique. La deuxième étape consiste à effectuer une immunomarquage de protéines du cytosquelette telles que la tubuline alpha ou la protéine associée aux microtubules deux, à l'aide d'anticorps infrarouges ayant des longueurs d'onde de 800 nanomètres.Ensuite, les cellules sont marquées avec le drac cinq infrarouge et le saphir pour colorer le noyau et le cytoplasme à 700 nanomètres. La dernière étape consiste à imager l'alpha-tubuline ou la MAP2 ainsi que le drac cinq plus le saphir aux longueurs d'onde de 700 et de 800 nanomètres sur un imageur infrarouge. En fin de compte, ces dosages luminescents et infrarouges fournissent des informations sur les structures anatomiques ainsi que sur la fonction physiologique.L'avantage principal de ces techniques par rapport aux méthodes existantes, telles que le test de viabilité MTT, réside dans la mesure rapide et sensible de plusieu

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Déterminer le nombre de cellules en culture est importante dans la normalisation des conditions de culture et de réaliser des expériences de quantification précise. Dans cette vidéo, nous démontrons comment les cellules sont comptées en utilisant un hématimètre.

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Test clonogénique: cellules adhérentes

Une modification en 3-D in vitro du système est présenté dans lequel les caractéristiques de croissance de plusieurs lignées cellulaires tumorales dans la membrane basale reconstituée en corrélation avec le comportement en sommeil ou de prolifération de cellules tumorales dans un site métastatique...

Une In Vitro Système d&#39;étude dormance tumorale et le commutateur à la croissance métastatique

Cette vidéo décrit une technique basée sur l’impédance cellulaire pour étudier la cinétique de survie des virus qui induisent des effets cytopathiques. La méthode mesure l’impédance électrique des cellules adhérentes infectées par le virus prétraitées avec une solution saline.

Test de cinétique de survie basé sur l’impédance cellulaire pour évaluer la survie du virus

Nous décrivons un test biologique simple, basée sur des cellules pour la détection, la quantification et le suivi de l'activité des membres de la famille du facteur de croissance endothélial vasculaire des ligands. L'essai utilise des récepteurs chimères exprimés dans une lignée cellulaire dépendant du facteur de fournir une évaluation semi-quantitative ou quantitative de la liaison au récepteur et la réticulation par le ligand.

Un bioessai simple pour l&#39;évaluation des facteurs de croissance endothélial vasculaire

Il est souvent nécessaire d'évaluer la cytotoxicité potentielle d'un ensemble de composés sur les cellules cultivées. Ici, nous décrivons une stratégie pour dépister de façon fiable les composés toxiques dans un format de 96 puits.

Une stratégie visant à identifier les composés qui affectent la croissance et la survie des cellules mammifères cultivées à un débit faible à modéré

Ici, nous présentons plusieurs méthodes simples pour évaluer la viabilité et la mort dans les sphéroïdes 3D de cellules cancéreuses, qui imitent les gradients physico-chimiques des tumeurs in vivo beaucoup mieux que la culture 2D. Le modèle sphéroïde permet donc d'évaluer l'efficacité du médicament contre le cancer avec une meilleure traduction aux conditions in vivo.

Évaluation de la viabilité cellulaire et de la mort dans les cultures sphéroïdes 3D des cellules cancéreuses

Ce protocole démontre des méthodes pour permettre la culture in vitro étendue des xénogreffes patient-dérivées (PDX). Une étape améliore la viabilité globale des cultures multicellulaires en grappes hydrogels 3D, grâce à l’élimination directe de cellules uniques non viables. Une étape secondaire démontre les meilleures pratiques pour la culture PDX dans une plate-forme microfluidique perfusée.

Viabilité améliorée pour les cultures Hydrogel 3D Ex vivo de xénogreffes dérivées du patient dans une plate-forme microfluidique perfusée

Ce protocole présente des tests de cytotoxicité couramment utilisés (tests Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red et MTT) adaptés à l’évaluation de la cytotoxicité dans des lignées cellulaires d’embryons de poisson zèbre (ZEM2S) et de foie (ZFL) dans des plaques à 96 puits.

Essais de cytotoxicité avec des lignées cellulaires de poisson zèbre

Nous présentons ici un protocole permettant de quantifier la survie post-stress dans des échantillons de levures. Le test utilise deux colorants fluorescents, SYTO 9 et l’iodure de propidium (PI), pour quantifier l’intégrité de la membrane plasmique. Il utilise la cytométrie en flux pour fournir des estimations quantitatives et reproductibles des fractions cellulaires vivantes, mortes et endommagées pour les échantillons de stress post-oxydatif.

Un test LIVE/DEAD optimisé couplé à la cytométrie en flux pour quantifier la survie post-stress dans les cellules de levure

Découvrez les tests de viabilité cellulaire combinant mesure d'ATP, immunomarquage et imagerie infrarouge pour évaluer la santé cellulaire. Cette méthode offre une analyse objective de l'intégrité structurale et métabolique.

Les analyses de viabilité de cellules en culture

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