Infinium Assay pour Grands génotypage SNP Applications

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser avec succès le test Infinium afin de traiter une puce de bille de génotypage. Ceci est accompli en amplifiant, fragmentant et isolant d’abord l’ADN. La deuxième étape consiste à hybrider le brin d’ADN dénaturé en oligonucléotides attachés à des billes sur le réseau.

Ensuite, l’oligonucléotide attaché à la bille est coloré et prolongé sélectivement d’une base. La dernière étape consiste à scanner les éclats de billes pour détecter le nucléotide marqué. En fin de compte, les résultats du génotype sont utilisés pour déterminer les allèles présents au site d’intérêt.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car de nombreuses étapes de coloration et de chargement des copeaux d’abeilles sont difficiles à apprendre. De nombreuses manœuvres ne se trouvent pas dans d’autres méthodes de génotypage et de nombreux équipements partagent des noms à consonance très similaire. Un jour avant l’amplification, préparez l’ADN et distribuez 200 nanogrammes d’ADN par puits dans une plaque d’échantillon de 96 puits profonds.

Au moins 96 échantillons doivent être plaqués pour s’assurer qu’aucun réactif ne sera gaspillé. Étiquetez la plaque avec un autocollant code-barres fourni par le kit et centrifugez-la afin de normaliser les volumes. Laissez les échantillons dans un tiroir ou une hotte pendant la nuit pour qu’ils évaporent le liquide.

Couvrez l’assiette sans serrer avec un couvercle ou une serviette en papier pour empêcher la poussière de pénétrer le lendemain matin. Vérifiez que les puits sont secs, qu’il s’agit d’un bassin de réactifs d’utilisateur sec et d’une pipette à huit canaux de 10 microlitres pour distribuer quatre microlitres de tampon DNA Resus dans chaque puits afin de réhydrater les échantillons. Si l’on prend soin de ne pas toucher le liquide, il n’est pas nécessaire de jeter les pointes de pipette entre chaque colonne.

Ensuite, versez 20 microlitres de MA un réactif dans chaque puits de la plaque à l’aide d’une pipette à huit canaux et d’un bassin de réactif frais. Couvrez la plaque avec un joint réutilisable, une centrifugeuse à impulsions et un vortex pendant une minute à 1600 tr/min sur un agitateur à microplaques, incubez à température ambiante pendant au moins 30 minutes. Les étapes restantes de l’amplification ne seront pas montrées dans cette vidéo, mais le protocole peut être trouvé dans le manuscrit ci-joint.

Une fois que tous les réactifs ont été ajoutés, placez la plaque dans un four correctement calibré réglé à 37 degrés Celsius pendant 20 à 24 heures. Après amplification, les échantillons d’ADN sont fragmentés et précipités comme décrit dans le manuscrit après précipitation dans une centrifugeuse à grande vitesse. Inspectez le bas de la plaque sans l’inverser.

Pour confirmer que les échantillons sont précipités dans une pastille bleue, jetez le couvercle et retirez rapidement le liquide en inversant la plaque et en la tapotant avec force sur la paillasse recouverte d’essuie-tout. Une fois la plaque inversée, veillez à ne pas la retourner. Tant qu’il reste du liquide à plusieurs reprises, tapotez la plaque contre le plan de travail jusqu’à ce que tout le liquide soit éliminé.

Placez la plaque sur un support de tube à essai inversé pour incuber à sec à température ambiante pendant une heure. Par la suite, l’ADN est remis en suspension pour commencer la procédure d’hybridation. Placez une plaque à 96 puits contenant de l’ADN remis en suspension sur un bloc chauffant à 95 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Pour dénaturer l’ADN après 20 minutes, retirez la plaque d’échantillon du bloc chauffant et incubez à température ambiante pendant 30 minutes pendant que la plaque d’échantillon refroidit, préparez la chambre de la ruche. Une chambre sera nécessaire pour quatre puces d’abeilles traitées. Placez un tapis en caoutchouc sur le dessus de la base de la chambre de la ruche, en alignant le trou le plus épais avec l’avant de la base.

Le symbole du code-barres gravé dans la base doit toujours être visible. À l’aide d’une pipette de 1000 microlitres, versez 400 microlitres de PB, deux réactifs dans chacun des huit réservoirs d’humidification creusés dans la base. Placez le couvercle de la chambre haute sur la base et fermez les deux extrémités en plaçant deux fermoirs sur des côtés opposés en diagonale.

Placez d’abord quatre inserts Hi Chamber sur le banc pour chaque hi room utilisé juste avant la fin des 30 minutes. Refroidir. Ouvrez les paquets de puces de perles d’argent.

Retirez les copeaux de leurs manchons en plastique transparent sans toucher les billes. Placez chaque puce d’abeille sur un insert de chambre haute. Orientation du code-barres à puce avec le symbole du code-barres gravé sur la surface supérieure de l’insert.

L’étape suivante, qui est le chargement des puces d’abeille, peut être l’étape la plus critique du protocole. Pour le faire correctement, il faut visualiser à l’avance le transfert de l’échantillon de la plaque d’ADN à la puce d’abeille, décoller et jeter le couvercle de la plaque d’échantillon. Une pipette multicanaux peut être utilisée pour distribuer du liquide sur les copeaux, mais il faut prévoir de n’aspirer que le nombre d’échantillons qui peuvent être placés en toute sécurité sur les puces d’abeille, car le nombre de rangées sur une plaque ne correspond pas toujours au nombre de rangées sur une puce.

Prélevez 15 microlitres d’échantillon sur la plaque d’échantillon et distribuez lentement à l’entrée du réseau. Un soin extraordinaire doit être apporté à placer le bon échantillon sur la bonne puce d’abeille dans la bonne position correspondant à la puce de bille. Ordonnance enregistrée plus tôt.

Ouvrez la chambre haute et placez les inserts sur les réservoirs d’humidification. Le code-barres de la puce doit être placé sur la gravure du code-barres dans la base de la chambre de la ruche. Replacez le couvercle de la chambre de la ruche et fermez les quatre fermoirs en fermant les fermoirs sur les côtés opposés en diagonale.

Tout d’abord, incubez la chambre haute dans un four à 48 degrés Celsius pendant 16 à 24 heures à la fin de l’hybridation, les chambres haute sont retirées du four et incubées à température ambiante pendant 25 minutes pour refroidir. Lorsque les chambres Hi ont refroidi, ouvrez une chambre Hi. Retirez le joint du couvercle d’un éclat d’abeille en saisissant le joint dans un coin et en le décollant doucement en diagonale.

Une fois le sceau retiré, placez immédiatement la puce sur un plateau de copeaux d’abeille et immergez-la dans un bac PB sans toucher les billes. Répétez l’opération jusqu’à ce que le plateau soit rempli de copeaux de perles. En prenant soin de ne pas laisser sécher les copeaux.

Agitez doucement le plateau pour éliminer les bulles et laissez les copeaux immergés pendant une minute. Agitez à nouveau le plateau. Déplacez le plateau de copeaux d’abeille dans un deuxième plat de lavage rempli de PB. On agite doucement et on laisse savonner pendant une minute.

Puis agiter à nouveau dans le flux de liquide à travers la station d’assemblage. Placez quatre entretoises en plastique noir dans les rainures. Remplissez la station avec PB one jusqu’à ce que le liquide atteigne presque la hauteur des huit supports d’assemblage, un à la fois.

Retirez les copeaux de perle du plateau et placez-les dans la station d’assemblage sur une entretoise en plastique, le code-barres de la puce doit être aligné au-dessus du symbole de code-barres gravé dans la station d’assemblage. Une fois que quatre puces sont dans la station d’assemblage, placez une entretoise en plastique transparent sur chaque puce de perle. Les bords extérieurs de l’entretoise doivent entourer les supports à l’intérieur de la station d’assemblage.

Placez la barre d’assemblage en plastique dans le poste de montage en l’ajustant sur les rainures. Placez doucement une lame de verre sur l’entretoise en plastique en poussant l’extrémité arrière de la glissière contre la barre d’assemblage et en abaissant lentement l’avant dans le liquide. La rainure sur le dessus de la glissière doit être orientée vers le bas, directement au-dessus du code-barres de la puce, en laissant un espace entre la puce d’abeille et la glissière à l’extrémité du code-barres.

Après avoir vérifié qu’il n’y a pas de bulles entre la puce et la glissière, enclenchez deux fermoirs métalliques autour du verre. Faites-en glisser un vers l’extrémité du code-barres et un vers l’arrière. Les bords des fermoirs en plastique doivent saisir le flux de plastique à travers l’entretoise sous la puce.

Cette figure montre un schéma d’assemblage complet. Une fois que toutes les billes sont dans leur flux à travers les assemblages, prenez une paire de ciseaux chirurgicaux et coupez les deux extrémités de l’entretoise aussi près que possible de la lame de verre Une fois que le support de la chambre est à 44 degrés, commencez cette procédure en plaçant un ensemble de flux de copeaux d’abeille sur le support de la chambre en faisant glisser l’ensemble vers le bas et en accrochant l’attelle en haut. L’arrière de la puce d’abeille doit toucher le support de la chambre.

La lame de verre doit être tournée vers l’extérieur avec la rainure en haut pour former un réservoir de réactif. Une fois que tous les assemblages de puces d’abeille ont été placés sur le support de la chambre, utilisez une pipette de 200 microlitres pour ajouter 150 microlitres de réactif AR aux assemblages d’écoulement. En distribuant le liquide dans le réservoir en verre, le réactif s’écoulera naturellement le long de la lame et sortira à la base de l’ensemble, ce qui permettra aux futurs réactifs d’être placés directement dans le réservoir.

Les étapes restantes pour teindre une extension ne seront pas montrées. Veuillez vous référer au protocole dans le manuscrit d’accompagnement à la fin de la coloration et de l’extension. Démontez l’ensemble d’écoulement en insérant une fine barre métallique entre les fermoirs et le renfort.

Puis en pivotant. Mettez de côté la lame de verre et retirez immédiatement l’éclat d’abeille, placez un éclat d’abeille dans un plateau vertical de jetons d’abeille et immergez-le dans un PB, répétez l’opération pour chaque assemblage d’écoulement. En prenant soin d’orienter chaque puce d’abeille dans la même direction et en minimisant leur exposition à l’air.

Terminez ensuite cette procédure. Selon le protocole dans le texte d’accompagnement, une puce d’abeille correctement traitée doit afficher des intensités de lumière laser rouge et verte brillantes et distinctes lorsqu’elle est scannée, car les nucléotides marqués qui ont été attachés lors des étapes d’extension et de coloration deviendront fluorescents sous les lumières des deux lasers. Voici un échantillon d’ADN génomique standard hybridé avec succès à un panel personnalisé de sections de réseau de génotypage SNP passant l’intensité.

QC mettra en évidence le vert sur l’affichage des puces d’abeille dans les sections gauches. Intensité défaillante. QC mettra en évidence le rouge sur l’écran de la puce d’abeille.

Une fois la numérisation terminée, les affichages rouge et vert se superposent. Une image agrandie est montrée ici alors que ces nucléotides étendent sélectivement la chaîne de nucléotides oligonucléotidiques de billes hybridées avec le brin d’ADN fragmenté. Et comme les chaînes nucléotidiques sont conçues pour se terminer sur le site de la variante, la couleur et l’intensité du signal résultant peuvent être utilisées pour déterminer les allèles présents sur le site SNP.

Les fichiers de sortie du scanner sont importés dans le logiciel d’analyse Genome Studio, qui génère des profils de cluster. Il s’agit d’un exemple de SNP valide avec trois grappes distinctes représentant les génotypes aa, A, B et B, B colorés respectivement en rouge, violet et bleu. Ce graphique d’intensité montre le SNP qui a nécessité la modification du cluster central noir, qui devrait être homozygote.

AB n’est pas appelé. Le cluster BB est appelé à tort ab. Le dernier graphique d’intensité montre un SNP peu performant.

Aucun génotype ne peut être obtenu à partir de ce graphique d’intensité car il n’existe pas de grappes distinctes. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de traiter rapidement les copeaux d’abeille. Ne les exposez pas à l’air pendant une période prolongée.