Микроинъекция раны Анализ и В естественных условиях Локализация эпидермального ран реагирования журналистам в Дрозофилы Эмбрионы.

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации in vivo репортера реакции эпидермальной раны у эмбриона дрозофилы. Это достигается путем предварительного сбора данных о стадии разработки, на которой активность репортера может быть последовательно обнаружена. Вторым этапом процедуры является прокол эмбриона с помощью стеклянной иглы и аппарата для микроинъекций.

Третий шаг – обезболивание эмбриона для визуализации репортера. Последним шагом является валидация локализации репортера путем обнаружения паттерна экспрессии РНК-зондов. В конечном счете, результаты могут показать специфическую активацию репортера реакции эпидермальной раны только в клетках, окружающих место проколотой травмы, с помощью конфокальной микроскопии.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, которые включают в себя изучение закрытия раны, заключается в том, что мы можем увидеть у живых эмбрионов экспрессию генов, которая запускается колотым ранением. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области восстановления тканей, например, как клетки, окружающие травму, регулируют немедленную реакцию раны, способствуя восстановлению. Применение этого метода распространяется на терапию или диагностику регенерации тканей, потому что регулирование реакции раны является начальным шагом.

Заживление раны может быть проверено на любой стадии развития. Однако к 17 стадии кутикула становится слишком зрелой. Известные репортеры ран не будут активированы.

Итак, чтобы продемонстрировать, стадии с 15 по 16 будут ранены для сбора эмбрионов. Соберите двух-трехдневных взрослых мух, 50 самок и 25 самцов. Переложите их в клетку для сбора эмбрионов со свежей тарелкой яблочного сока, агара и ложкой дрожжевой пасты.

Поставьте в клетку при температуре 25 градусов Цельсия каждое утро в течение следующих трех дней. Замените тарелку на новую. Во второй половине третьего дня дайте яйцам накопиться на свежей тарелке в течение двух часов.

Храните эту тарелку в течение 14 часов при температуре 25 градусов по Цельсию. Двухчасовая кладка должна дать около 200 эмбрионов на следующий день. Добавьте в тарелку несколько миллилитров воды и аккуратно взболтайте ее.

Затем с помощью кисти переложите воду и зародыши с тарелки в корзину из капроновой сетки в пробирке для сбора. Теперь сделайте неглубокую ванночку с отбеливателем и замочите в ней зародыши на две минуты. На этом этапе удаляются CORs, яйца.

Ракушку несколько раз покрутите в ванне, чтобы предотвратить слипание эмбрионов. Через две минуты промойте эмбрионы проточной водой и ополосните чашку Петри в течение пяти секунд каждый. Затем переложите корзинку с эмбрионами на бумажное полотенце, чтобы высушить эмбрионы.

Далее с помощью препарирующей иглы переместите около 50 эмбрионов из сетки на агаровую пластину, сделанную из зеленого пищевого красителя. Краситель предназначен для улучшения видимости коленных яиц. Под рассекающим скопом сделайте два параллельных ряда эмбрионов на расстоянии примерно пяти миллиметров друг от друга.

Расположите ряды друг от друга на ширину зародыша, чтобы обеспечить газообмен. Далее осторожно прижмите горку с двойной клейкой лентой к эмбрионам так, чтобы ряды были перпендикулярны длине горки. Чтобы снизить их внутреннее давление, дайте эмбрионам высохнуть на воздухе.

Таким образом, они не лопнут, когда их ранят. Через 25 минут первая подготовленная горка должна быть сухой. Теперь накройте эмбрионы двумя-тремя каплями гало-углеродного масла, чтобы предотвратить дальнейшее обезвоживание, и немедленно приступайте к нанесению ран сухим эмбрионам.

Поместите предметное стекло эмбриона в предметный столик для инъекционного микроскопа. Найдите эмбрионы в поле зрения и потренируйтесь в перемещении предметного столика инвертированного микроскопа. Теперь сфокусируйтесь на средней плоскости эмбриона вдоль дорсальной вентральной оси и выведите в поле зрения верхний зародыш первого выровненного ряда.

Далее аккуратно поместите и закрепите вытянутую иглу в иглодержателе. С помощью микроманипулятора переместите иглу вниз к предметному стеклу. Выровняйте иглу с эмбрионом в той же фокальной плоскости.

Теперь не регулируйте микром манипулятор дальше. Теперь переместите ступень, чтобы проколоть эмбрион насквозь. Затем переходите к следующему эмбриону в ряду.

После ранения первого ряда полностью переместите иглу вверх и в сторону от сцены. Затем поверните предметное стекло и продолжайте прокалывать зародыши во втором ряду. После того, как все эмбрионы будут ранены, их можно немедленно зафиксировать для внутренней гибридизации или окрашивания антителами.

Для исследования флуоресцентные репортеры ждут от четырех до шести часов и переносят эмбрион на новый предметное стекло, помещают стеклянные бусины вокруг эмбрионов. Затем добавьте несколько капель 50%Один фенокси, два пропанола, который является обезболивающим, и наложите на эмбрионы покровную пленку для микроинъекций. Загрузите иглу для инъекций с тыльной стороны одним микролитром химического раствора плюс краситель, например, 0,6 молярной перекиси водорода.

Позвольте капиллярному действию нарастить химический раствор до кончика иглы. Далее разломайте кончик иглы о край крышки в гало углеродно-масляной смеси. Сначала сфокусируйте установленную иглу так, чтобы край наклонной крышки скользил под углом не совсем 90 градусов.

Далее аккуратно переместите край чехла по кончику иглы до тех пор, пока он не сломается. Затем надавите на аппарат для микроинъекций и проверьте, что раствор вытекает из иглы. Если она не течет, разломайте иглу еще немного.

Теперь выполните ту же процедуру, которая используется только для пункции эмбрионов. На этот раз микро вводят раствор одновременно с проколом. В идеале вводить 10 нанолитров.

Если в эмбрион будет введено слишком много раствора, мембрана Витале лопнет, во время выполнения процедуры фиксации в текстовом протоколе обратите особое внимание на следующие шаги. Используйте стеклянную пипетку, а не пластиковую, чтобы промыть гептан над предметным стеклом, и используйте стекло, чтобы закрутить эмбрионы в центре стеклянной чашки Петри. Позже встряхните эмбрионы в фиксаторе в течение 25 минут при 220-230 оборотах в минуту.

После встряхивания дайте пузырькам на границе раздела лопнуть, прежде чем полностью удалить нижнюю водную фазу. Кроме того, будьте осторожны, чтобы не вытащить эмбрионы. После добавления метанола раненые эмбрионы должны сгруппироваться на границе раздела, распределить эмбрионы по поверхности пластины таким образом и перенести их на предметное стекло с двойной клейкой лентой.

Затем осторожно надавите на эмбрионы иглой для препарирования, чтобы лопнуть мембрану Витале и приступайте к обезвоживанию. Мух дикого типа трансформировали с помощью флуоресцентных репортеров, слитых с усилителями ДОФА-декарбоксилазы или тирозингидроксилазы, и подвергали описанному анализу. При ярком поле можно было увидеть место раны, в то время как при флуоресцентном освещении можно было увидеть активность репортера раны DCD.

Репортер по тирозингидроксилазе показал аналогичный результат. Оба изображения были собраны на двухконфокальный микроскоп Leica SP с 20-кратным объективом. Процедура проводилась при потере функции потока у двух мутантов.

Актуальность: репортерная активность ДОФА-декарбоксилазы была расширена во всех клетках эпидермиса при усилении потока функций двух мутантов, образованных с повсеместной экспрессией во всех клетках. Ингибирование репортера отмечалось по всем клеткам эпидермиса. Затем эмбрионы были одновременно ранены и им было введено солюбилизированное соединение и перекись водорода с синим красителем и водой, которые расширили активность репортера DOPA-декарбоксилазы в эпидермальных клетках, как и инъекция метил-B циклодекстрина в гидроксид натрия с использованием внутренней U-гибридизации.

Транскрипционную активацию генов раневого ответа проводили методом анализа эндогенной ДОФА-декарбоксилазы. Было замечено, что экспрессия РНК локализована вокруг места раны, и, конечно же, тирозингидроксилаза, транскрипты РНК также накапливаются в месте раны. После освоения этой техники ее можно выполнить за 60 минут при правильном выполнении.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно не тратить слишком много времени на выравнивание эмбрионов и двигаться вперед к следующим шагам процедуры.