Antipsikotik İlaçların Etki Mekanizmaları incelenmesi için Yöntemleri Caenorhabditis elegans

Bu işlemin genel amacı, antipsikotik ilaçların deniz elganının gelişimi ve faringeal pompalanması üzerindeki etkilerini incelemektir. Bu, önce bir yetişkin nematod popülasyonunun büyütülmesi ve bunlardan senkronize bir hayvan popülasyonu oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, senkronize yumurtaları veya yetişkinleri ilaca bağlı tahlil plakalarına aktarmaktır.

Son adım, ilaçların solucanlar üzerindeki etkilerini gözlemlemek ve puanlamaktır. Sonuç olarak, sonuçlar, antipsikotik ilaçların ilaca maruz kalan hayvanlarda gelişimi geciktirdiğini ve faringeal pompalamayı inhibe ettiğini gösterebilir. Bu yöntem, antipsikotik ilaçların etki mekanizmaları hakkında fikir verebilse de, diğer küçük molekülleri ve hatta lipitler gibi büyük molekülleri incelemek için de uygulanabilir.

Kuyu başına orta olmak üzere iki mililitre NGM ile 12 oyuklu bir plaka yükleyerek başlayın. Oda sıcaklığında sertleşmesi için plakayı bir kenara koyun. Daha sonra, bir OP 50 bakteri kolonisi seçin ve 50 mililitrelik bir LB kültürü şişesine aktarın.

Bakteriler gece boyunca 37 santigrat derecede ve ertesi gün 220 RPM'de çalkalayarak hazırlanan plakanın her bir oyuğuna yerleştirilir. Bakteri kültürünün 20 mikrolitresinde, plakayı ertesi gün gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edilecek şekilde ayarlayın. Her oturmuşu, çalışma konsantrasyonunda 80 mikrolitre ilgilenilen ilaçla iyice yükleyin.

Bu durumda, ilaç C Klozapin'dir. Alikotları almadan önce çözeltiyi girdapladığınızdan emin olun. Çözeltiyi kuyuya eşit olarak dağıtmak için döndürün ve plaka kapağı kapalıyken oda sıcaklığında emilmesine izin verin.

Daha sonra tahlile devam edin veya plakayı gece boyunca 20 santigrat derecede saklayın ve ertesi gün tahlile başlayın. İlgilenilen genotipten yumurta toplayarak başlayın. Birçok GR yetişkini olan bir solucan popülasyonu ile başlayın.

Solucanları 3,5 santimetrelik bir plakada M dokuz tampon kullanarak yıkayın. Daha sonra 15 mililitrelik bir tüpte 2000 RPM'de bir dakika boyunca döndürün. Süpernatanı aspirasyon yoluyla çıkarın ve beş mililitre çamaşır suyu ile değiştirin.

Daha sonra tüpü ters çevirerek yetişkinleri nazikçe parçalayın ve hayvanların sürekli olarak çözülmeye başlamasını bekleyin. Dürbün altında çözünen solucanları gözlemleyin. Solucanların yaklaşık yarısı çözüldüğünde.

Yaklaşık beş dakika sonra, yumurtaları toplamak için tüpü aşağı döndürün, süpernatanı aspire edin ve hızlı bir şekilde M dokuz tamponu ile değiştirin. Ardından tüpü daha önce olduğu gibi tekrar döndürün ve M nine süpernatantının yaklaşık 100 mikrolitresi hariç hepsini çıkarın. Yumurtaları askıya almak için tüpü girdaplayın.

Daha sonra süspansiyonun iki mikrolitresini bir NGM plakasına aktarın ve aktarılan yumurta sayısını sayın. Daha sonra ilaçla muamele edilmiş plakayı oyuk başına 30 ila 35 yumurta ile yükleyin ve plakayı 24 saat boyunca 20 santigrat derecede inkübe edin. 24 saat sonra, kuluçkalanmış yumurta sayısını puanlayın.

Herhangi birinde 25'ten fazla solucan varsa, fazla solucanları iyice çıkarın. Plakadaki solucanları, her gün 24 saatlik aralıklarla daha sonra gözlemlemek üzere kuluçka makinesine geri koyun, solucanların büyüklüğüne ve vulvalarının şekline göre kuyucuklardaki solucanların gelişim aşamasını puanlayın. Sağlam etkiler genellikle üçüncü ve dördüncü günlerde görülür.

Deney yaklaşık bir hafta sürmelidir. Bu protokol için, bir gün önce tarif edildiği gibi ilaç test plakaları hazırlamış ve tahlili başlatmış olun. Deneydeki her genotip için 50 L dört aşamalı hayvan seçin.

Bunları NGM plakalarına aktarın ve plakaları 20 santigrat derecede 24 saat inkübe edin. Ertesi gün, her 15 ila 20 dakikada bir, bir grup yarım saat ilaca maruz kaldıktan sonra 10 hayvanla bir test kuyusu yükleyin. Diseksiyon mikroskobu altında faringeal pompalamalarını gözlemlemeye başlayın.

Önce bir solucan bulun, ardından faringeal pompalarını 20 saniye boyunca sayın. Puanlandıktan sonra, solucanı plakadan alın. Kuyudaki tüm solucanları aynı şekilde puanlayın.

Deneysel gecikmenin yürütülmesinin beklenen sonuçları. Yabani tip kontrollerle yapılan ölümcüllük testi, mezara kadar tipik büyüme hızının aksine, yetişkin aşamasında, c klozapine maruz kalan hayvanların hala genç larva aşamalarında olduğunu veya farklı klozapin konsantrasyonlarında mutantları test ederek, dilsiz bir gibi baskılayıcı mutantları ve MU iki gibi arttırıcı mutantları ortaya çıkardığını göstermelidir. Evrensel olarak, dilsiz olanın ölümcüllüğü vahşi tipten daha düşüktü ve MU iki'nin ölümcüllüğü, dilsiz bir hayvanın daha fazla gelişebildiği kontrole kıyasla beklendiği gibi daha yüksekti, oysa dilsiz iki hayatta kalan daha gecikmelidir.

Daha ileri incelemeler, Klozapin maruziyetinin konsantrasyona bağlı bir şekilde faringeal pompalama oranlarını azalttığını ortaya koydu. Bununla birlikte, dilsiz olanın azalan oranı vahşi tipten daha azken, dilsiz ikilinin azalmış oranı vahşi tipten daha büyüktü. Bu videoyu izledikten sonra, küçük ölçekte antipsikotik ilaç testinin nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız.

Mesaj, büyük ölçekli bir genetik tarama yapmak için de ölçeklendirilebilir.