Visualisierung des endoplasmatischen Reticulum Subdomains in kultivierten Zellen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, zu untersuchen, wie transfizierte fluoreszierende Proteine im endoplasmatischen Retikulum verteilt sind und sich bewegen und den Einfluss der Expression auf die ultrastrukturelle Architektur zu bewerten. Zu diesem Zweck werden kultivierte Zellen transient mit GFP-markierten, schwanzverankerten ER-residenten Proteinen transfiziert. Nach der Transfektion wird eine konfokale Bildgebung lebender Zellen durchgeführt, um die Fluoreszenzerholung nach Photobleichung oder Frap und Fluoreszenzverlust zu beurteilen.

Beim Photobleaching oder Flip wird die Ultrastrukturanalyse mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie durchgeführt. Die daraus resultierenden Daten zeigen, dass die Expression des GFP-markierten B-Fünf-Konstrukts die Organisation und Struktur des endoplasmatischen Retikulums dramatisch verändert und die Bildung von Aggregaten induziert. Die Methode, die wir hier demonstrieren, kann Einblicke in grundlegende zellbiologische Prozesse geben, wie z.B. die Mobilität und den Transport von Proteinen und Lipiden.

Es kann auch verwendet werden, um das Ansprechen auf pharmakologische Behandlungen zu untersuchen, um fluoreszierende Proteine, die Oligomodernisierung zu bewerten, oder um die Rolle pathogener mutierter Proteine bei der Bildung intrazellulärer Aggregate des Ursprungs zu untersuchen, die für ihre Pathogenität relevant sein können, wie z. B. bei atrophischer Lateralsklerose. Das in dieser Studie verwendete Plasmid besteht aus einer verbesserten Version von GFP, die an seinem C-Terminus über eine Linkersequenz mit der Schwanzregion des er fusioniert wurde, einer Isoform von Ratten-Cytochrom B fünf. Die Schwanzregion von B fünf enthält die gesamte Sequenz, die nach der Spaltung durch Trypsin membranassoziiert bleibt.

Dazu gehört die Transmembrandomäne mit 17 Resten, flankiert von vor- und nachgelagerten polaren Sequenzen. Der Linker besteht aus dem M-Epitop, gefolgt von GLY vier S3. Die gesamte CDNA wird in die Hindi-drei XO eins Stellen des Säugetier-Expressionsvektors PC DNA drei eingefügt. Zur Vorbereitung auf die Transfektion kosteten das Wachstum sieben Zellen in supplementiertem DMEM bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 am Tag vor der Transfektionsplatte dreimal 10 bis zu den fünften Zellen auf runden 24 Millimeter Glasdecke, die am nächsten Tag in eine Sechs-Well-Platte geschoben wird.

Transfizieren Sie die Zellen mit dem Jet-PEI-System, wie vom Hersteller hier beschrieben, wird ein Jet-, PEI-zu-DNA-Verhältnis von zwei zu eins verwendet. Dies führt in der Regel zu einer Transfektionseffizienz von 70 bis 80 %Halten Sie die Zellen vor der Bildgebung 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Als nächstes wird mit einer Pinzette ein Deckglas mit transfizierten Zellen in die Bildgebungskammer übertragen.

Stellen Sie die Gewebekulturschale wieder in den Inkubator, um die restlichen Zellen zu retten. Für die Ultrastrukturanalyse mittels Elektronenmikroskopie. Für die Bildgebung von lebenden Zellen geben Sie zwei Milliliter Bildgebungsmedium in eine Zellkulturkammer aus Stahl.

Xi Fluor ist im Bildgebungsmedium enthalten, um ein Photobleichen der Proben zu verhindern. O Die Versuche müssen in Gegenwart von Smid, einem Translationsinhibitor, durchgeführt werden, um einen Anstieg des A-Fluoreszenzsignals und damit eine Gesamtfluoreszenz aufgrund des Proteins zu vermeiden. Biosynthese. Stellen Sie die Bildgebungskammer auf den Tisch eines konfokalen Mikroskops, das mit einem temperaturgesteuerten CO2-Inkubator und geeigneten Lasern mit geeigneten Photomultiplier-Einstellungen ausgestattet ist, um eine Fluoreszenzwiederherstellung durchzuführen.

Nachdem Photobleaching oder Fracking die Zellen scharf gestellt haben, stellen Sie die Aufnahmeparameter ein, um eine Sättigung der Pixel zu vermeiden. Achten Sie außerdem darauf, dass die Laserleistung so niedrig wie möglich eingestellt ist, um ein Ausbleichen des Lichts durch die Bildaufnahme zu vermeiden. Nachdem Sie die Bildgebungsparameter eingestellt haben, wechseln Sie zu einem neuen Sichtfeld mit zwei oder mehr Zellen.

Eine Zelle in jedem Erfassungsfeld sollte ungebleicht bleiben, damit sie zur Normalisierung des Fluoreszenzsignals der gebleichten Zelle oder Zellen verwendet werden kann. Zum Bleichen. Zeichnen Sie einen Bereich of Interest oder ROI, der einem organisierten glatten endoplasmatischen Retikulum oder OSER entspricht.

Stellen Sie das Bildgebungsprogramm mit einer angemessenen Anzahl von Iterationen auf Bleichen ein, um ein effizientes und schnelles Photobleaching zu gewährleisten. Bei Bedarf kann eine Kombination aus 488-Nanometer- und 405-Nanometer-Lasern verwendet werden. Weisen Sie die Software an, während des gesamten Verlaufs des Experiments 10 Minuten lang alle 10 Sekunden ein einzelnes Bild aufzunehmen. Dazu gehören die Vor-, Bleich- und Erholungsphasen.

Sobald alles fest ist, starten Sie das Bleichen und Einfangen. Wenn die Aufnahme abgeschlossen ist, wechseln Sie zu einem neuen Sichtfeld und wiederholen Sie diesen Vorgang. Erfassen Sie vier bis fünf Sichtfelder für jedes Cover.

Daneben schieben, um den Fluoreszenzverlust beim Photobleichen zu messen oder zu spiegeln. Weisen Sie das Programm an, eine Sequenz von Bleaching- und Post-Bleaching-Bildgebung für 10 Sekunden alle 30 Sekunden für 10 Minuten durchzuführen und dann in ein neues Sichtfeld zu wechseln. Zeichnen Sie einen ROI, der einer OSER-Struktur entspricht, und initiieren Sie das Bleaching und die Erfassung wie zuvor für die Analyse.

Importieren Sie die Frap- und Flip-Bilder in die Image J-Software. Bewerten Sie zunächst die Fluoreszenzerholung des gebleichten ROI im Laufe der Zeit für die Frack-Experimente und bestimmen Sie dann die Hintergrundfluoreszenz, indem Sie einen Bereich außerhalb der Zellen auswählen und deren mittlere Intensität über die Zeit messen. Subtrahieren Sie als Nächstes das Hintergrundsignal von den Fluoreszenzintensitäten der ROIs.

Normalisieren Sie die Daten auf die Gesamtfluoreszenz der gebleichten Zelle, die über die Zeit konstant sein sollte. Passen Sie dann die hier gezeigte monoexponentielle Gleichung an, wobei F post das Fluoreszenzsignal nach dem Photobleaching ist. F rec ist der maximale Fluoreszenzerholungswert, der nach dem Bleichen erreicht wird, T ist die letzte Zeit der Registrierung und tau ist die mittlere Zeit der Registrierung.

Für die Analyse der Flip-Experimente zeichnen Sie einen ROI außerhalb des gebleichten OSER, der die gesamte Zelle abdeckt, und messen Sie seine Fluoreszenzintensität über die Zeit. Wie bei Frack-Experimenten subtrahieren Sie den Hintergrund, indem Sie einen Bereich außerhalb der Zellen verwenden. Normalisieren Sie die Daten auf die Fluoreszenzniveaus eines ROI, der auf einer ungebleichten Zelle gezeichnet wurde, um eine durch die Bildgebung selbst verursachte Abnahme der Fluoreszenz zu korrigieren.

Zeichnen Sie abschließend die Ergebnisse mit GraphPad Prism oder einer ähnlichen Software. Viele der Reagenzien, die bei der Vorbereitung der Proben für die Elektromikroskopie verwendet werden, sind giftig. Daher sollten die folgenden Schritte mit einem Laborkittel und Handschuhen durchgeführt werden, während unter einem Abzug gearbeitet wird.

Nachdem Sie das Deckglas für die optische Mikroskopie von der Petrischale entfernt haben, fixieren Sie die restlichen auf dem Boden der Schale gewachsenen Zellen als Monoschicht für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Nehmen Sie anschließend die Zellen mit einem Teflonschaber ab und überführen Sie sie in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 9.000 G für 10 Minuten nach dem Schleudern. Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie frisches Fixiermittel hinzu und lassen Sie es am nächsten Tag über Nacht bei vier Grad Celsius stehen.

Waschen Sie die Pellets, indem Sie das Fixiermittel vorsichtig mit einer früheren Pipette ansaugen und Cate-Puffer hinzufügen. Um das Pellet nicht zu stören, lassen Sie den Puffer beim Hinzufügen an der Seitenwand des Rohrs herunterlaufen. Aspirieren Sie die Waschlösung und fixieren Sie sie, indem Sie Zellen in einer Lösung von 1 %igem Osmiumtetroxid in Cate-Puffer für eine Stunde bei Raumtemperatur hinzufügen.

Spülen Sie anschließend mit Milli Q Wasser ab und geben Sie 1%Urinalacetat in destilliertem Wasser direkt in das Mikrozentrifugenröhrchen. Befreien Sie den Fleck für 20 Minuten bis zu einer Stunde, dehydrieren Sie die Proben in einer zunehmenden Ethanolserie von 70 %, 80 %, 90 %, 100 % und 100 % erneut für jeweils 10 Minuten. Waschen Sie die Pellets dann zweimal für jeweils 15 Minuten in Propylenoxid.

Infiltrieren Sie die Proben, indem Sie das Propylenoxid durch die Eins-zu-Eins-Mischung aus Propylenoxid und Epon inkubieren und mindestens zwei Stunden lang und sogar über Nacht inkubieren. Um die Proben einzubetten, legen Sie anschließend die Zellpelletfragmente in Einbettungsformen, die mindestens 24 Stunden lang mit Epon-Epoxidharz bei 60 Grad Celsius ausgehärtet sind. Montieren Sie den Harzblock am nächsten Tag auf ein Ultramikrotom, das mit einem 45-Grad-Diamantmesser ausgestattet ist.

Schneiden Sie die Harzblöcke mit einem Trimmmesser manuell ab, um die Teile des Harzblocks zu entfernen, in denen die eingebettete Probe nicht vorhanden ist. Dann erhalten Sie mit dem Ultramikrotom Schnitte von 60 bis 70 Nanometern. Sammeln Sie die Abschnitte auf Kupfergittern mit 300 Maschen, um die Abschnitte zu färben.

Legen Sie die Gitter auf 30 Mikroliter einer gesättigten Lösung aus Urinal und Acetat und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang. Spülen Sie dann dreimal in Milli Q Wasser ab und inkubieren Sie die Gitter erneut sieben Minuten lang auf kleinen Tropfen Bleicitrat. Waschen Sie die Gitter nach der Inkubation gründlich, indem Sie sie in milli Q Wasser tauchen und bei Raumtemperatur trocknen lassen.

Betrachten Sie die gefärbten Gitter mit einem Transmissionselektronenmikroskop und nehmen Sie Bilder mit einer unten montierten CCD-Kamera bei abschließender Vergrößerung im Bereich von 6.000 bis 39.000 x auf, um die laterale Diffusion von D-E-G-F-P ER in einem organisierten, glatten endoplasmatischen Retikulum zu untersuchen. Transient transfizierte verursachte sieben Zellen von drei Deckgläsern wurden mit frap analysiert, wie in diesem Video beschrieben, wie in dieser Zeitraffersequenz gezeigt, zwei OSER-Strukturen wurden gebleicht und die Fluoreszenzerholung wurde über die Zeit aufgezeichnet. Eine Minute nach dem Bleaching wurde eine klare Fluoreszenzerholung mit einem weiteren Signalanstieg vier Minuten später nachgewiesen, um die Halbzeit der Wiederfindung zu bestimmen und den mobilen Anteil von D-E-G-F-P-E-R zu quantifizieren.

Die aufgenommenen Bilder wurden wie in diesem Video beschrieben analysiert, wie hier zu sehen ist. Die Fluoreszenzintensität des gebleichten Bereichs nahm mit der Zeit zu, was zeigt, dass das fluoreszierende Protein innerhalb der Aggregate sehr mobil ist. Um die Kontinuität zwischen verschiedenen Subdomänen des endoplasmatischen Retikulums zu untersuchen, wurden Flip-Experimente durchgeführt, wie in dieser Zeitraffersequenz gezeigt.

Das kontinuierliche Bleichen eines OSER, das hier durch den gelben Pfeil angezeigt wird, bewirkt eine fortschreitende Abnahme der Fluoreszenz im Rest des ER und in anderen OSER-Strukturen innerhalb derselben Zelle. Der rote Pfeil zeigt einen Teil einer ungebleichten Zelle, in dem das Fluoreszenzsignal über die Zeit konstant ist. Die quantitative Analyse dieser Daten ergab eine fortschreitende und schnelle Entleerung des retikulären ER, was zeigt, dass die Aggregate physikalisch mit dem Rest des ER verbunden sind. Um die feine Architektur dieser Aggregate zu untersuchen, wurden Zellen, die hohe Mengen an D-E-G-F-P ER exprimieren, mit einem Transmissionselektronenmikroskop beobachtet.

Diese Mikroskopische Aufnahme zeigt eine Ansicht des Zellzytoplasmas mit geringer Vergrößerung, das ein Aggregat von Membranen enthält. Das Aggregat besteht aus Stapel-Cyi und wellenförmigen Sinusmembranen. Wie hier zu sehen ist.

Mitochondrien sind um die OSER-Strukturen gruppiert, während Ribosomen, die durch die Pfeilspitzen angedeutet sind, nur die Membranen des äußersten Cyi schmücken. Beachten Sie, dass der 11 Nanometer dicke elektronendichte Raum zwischen den Membranen mit dem Zytoplasma kontinuierlich ist. Ein OS ER kann durch lamelläre er gebildet werden, bei denen es sich um Stapel von abgeflachten Er cyi handelt, die in ihrem Aussehen in dünnen Abschnitten kontinuierlich oder fragmentiert sein können, Vesikel, die aus der äußersten Zisterne des Stapels knospen, können gelegentlich beobachtet werden, wie hier gezeigt.

Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die fluoreszierenden Aggregate, die in kultivierten Zellen beobachtet wurden, die mit D-E-G-F-P ER transfiziert wurden, Flecken aus glatten und abgeflachten Ern darstellen, die sich räumlich in wohldefinierten 3D-Geometrien organisieren. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, alle Bilder ohne gesättigte Pixel aufzunehmen, da dies die Fluoreszenzwiederherstellung und damit die Analyse der Proteinmobilität beeinträchtigen kann. Achten Sie immer darauf, das Fluoreszenzsignal im Bleichmittel zu normalisieren, d. h. den Bereich, der für die Gesamtfluoreszenz derselben Zelle von Interesse ist, um Schwankungen der Fluoreszenzintensität aufgrund von Bleichen während der Bildaufnahme oder kleinen Änderungen in der Fokusebene zu berücksichtigen.