Vitro Hücre Göç ve Invasion Tahliller

Hücre göçü oldukça dinamik bir süreçtir. Normal embriyonik gelişim, bağışıklık tepkisi ve hastalık süreçleri gibi çeşitli fizyolojik işlevler için önemlidir. Örneğin, kanser metastazı ve iltihabı.

Hücre göçü çalışması, kanser biyolojisi, immünoloji, hücre biyolojisi ve gelişim biyolojisi gibi çok çeşitli biyomedikal bilimler için önemlidir. Hücre göçü, ekstansiyon, yeni adezyonların oluşumu, hücre gövdesi kasılması ve son olarak kuyruk ayrılması olmak üzere mekanik olarak dört ayrı aşamaya ayrılabilir. Burada, in vitro hücre göçünün dinamik doğasını dikkatlice incelemek için iki basit yöntemi açıklayacağız.

İlk yöntem, muhafaza tahlilinin bir hücre kültürüdür. Bu test yaygın olarak kullanılır ve en temel laboratuvar kurulumlarına sahip laboratuvarlar için yüksek düzeyde erişilebilirdir. Muhafaza tahlilinin hücre kültürü, bir pipet ucu ve birleşik bir hücre tek tabakası üzerinde oluşturulan çizikler kullanılarak, birleşik hücre tek tabakasının zamanla daha önce yapılmış olan yarayı kapatacağı bir tahlildir.

Hücre göçünün dinamikleri, zaman operasyonları fotoğrafçılığı veya anlık görüntüler kullanılarak ayrıntılı olarak incelenebilir. Mesafe ölçülebilir ve zamanla hücrelerin hareket ettiği hız hesaplanabilir. İkinci ilgili yöntem olan transwell hücre göçü ve istila testi, hücrelerin bir transwell membranı üzerine kaplanmasının ardından da oldukça erişilebilirdir.

Yaygın olarak boyden odası olarak da bilinir. Kemoterapi cezbedici gradyana doğru göç yetenekleri ölçülebilir. Bu son derece erişilebilir deneysel prosedürlerin her ikisi de birçok araştırma alanında son derece paha biçilmezdir.

İkinci bölüm, hücre Kültürü Muhafazası, tahlil. Merhaba, benim adım Calvin Justice. East Carolina Üniversitesi Brody Tıp Fakültesi Onkoloji Bölümü'nden Dr.Yang'ın laboratuvarında yüksek lisans öğrencisiyim.

Ve bugün, in vitro hücrelerle göç ve istila yeteneklerini ölçen iki prosedürü göstereceğim. Şimdi hücre kültürü muhafazasına başlayalım. Deneme: Hücre kültürü muhafazasında kullanılan hücreler.

Tahlil, konvansiyonel hücre kültürü teknikleri kullanılarak doku kültürü plakalarında büyütülebilir. Hücreleri büyütmek için kullanılan büyüme ortamını aspire etmeye başlamak için, PBS ile bir kez yıkayın, daha sonra plakaya% 0.25 tripsin EDTA'ya iki mililitre ekleyin ve üç dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. Plakayı inkübatörden çıkarın ve% 10 FES ile desteklenmiş üç mililitre DMM ekleyin.

Ortamı plakadan çıkarın ve 15 mililitrelik bir konik tüpe koyun. Beş dakikalık 1500 RPM santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, hücreleri% 10 FES ile desteklenmiş iki mililitre DMM içinde yeniden askıya alın.

Sonra hücreleri bir hemo sitometre ile sayın. Bittiğinde, 24 saat içinde birleşecek bir dizi hücre sayma plakası. Hücrenin bağlanmasına ve yayılmasına izin vermek için plakayı 24 saat boyunca inkübatöre koyun.

Plakayı inkübatörden çıkarın ve plakanın %100 birleşik olduğundan emin olmak için mikroskobun altına bakın. Biyogüvenlik başlığının ardından, doku kültürü plakasına zarar vermeden pipet ucunu dikkatli bir şekilde kullanarak, kuyunun tepesinden dibine doğru bir yara açın. Pipet ucuyla yarayı oluşturduktan sonra, ortamı aspire edin ve iki mililitre büyüme ortamı ile nazikçe yıkayın.

Bu durumda DMEM, mevcut kalıntıları yıkamak için %10 FES ile desteklenir ve bir kez daha ortamı aspire eder. Son olarak, iki mililitre büyüme ortamı ekleyin ve varsa, oyunu mikroskobun altındaki sıcaklık ve CO2 kontrollü bir odaya yerleştirin. Kasada hızlandırılmış fotoğrafçılık özelliği.

Hızlandırılmış çekim özelliği mevcut değildir. İşaret yerinin ve kuyunun ilk fotoğrafını çekin ve plakayı inkübatöre koyun. Zaman atlamalı çekim mevcutsa, mikroskopta zaman atlamalı çekim özelliklerini ayarlayın.

Zaman atlamamızı 16 saat olarak ayarlayacağız. 16 saat sonra her beş dakikada bir çekilen bir resimle, plaka odadan çıkarılabilir ve deney süresince elde edilen resimler bir flash sürücüye kaydedilebilir. USB'yi bilgisayara takın ve Image J Programını açın.

Dosyayı tıklayın. Bir görüntü dizisini içe aktarın. Deney sırasında çekilen görüntüleri bulun.

İlk dosyayı tıklatın ve aç'ı tıklatın. Sonraki sıra seçenekleri görünecektir. Fotoğraf listenizdeki ilk resmi seçin ve video için ihtiyaç duyacağınız artışları ekleyin.

Şimdi bir VI okuyucu seçeneklerini göreceksiniz. En iyi hangisini seçeceğinizi, deneyeceğinizi ve tıklayacağınızı seçin. Tamam. Image J programı şimdi bir video oluşturacak, videoyu kaydedecek, dosyayı tıklayacak, VI olarak kaydedecek veya deneyinize uygun olabilecek başka bir seçenek olacaktır.

Video daha sonra ilgi çekici olabilecek göç özellikleri için hücre çalışmasında analiz edilebilir. İncelenebilecek olası özellikler La Malo Podal uzaması, hücre gövdesi kasılması ve kuyruk ayrılmasıdır. Zaman kaybı fotoğrafçılığının yokluğunda, ilk resmi takip eden 12 ila 16 saat boyunca inkübatöre yerleştirilen plaka çıkarılabilir.

Başlangıçta fotoğrafı çekilen alan tekrar fotoğraflanmalı ve daha sonraki ölçümler için bir ölçek çubuğu eklenmelidir. İlk fotoğrafta oluşturulan yaranın ilk genişliği ölçüldükten sonra, piksel cinsinden ölçülen genişlik bir ölçek çubuğu kullanılarak mikrometreye dönüştürülmelidir. Daha sonra, son resimlerin yara genişliği, daha önce olduğu gibi aynı alanda piksel cinsinden ölçülmeli ve yine ölçek çubuğu kullanılarak mikrometreye dönüştürülmelidir.

Son adım, yaranın ayrılan süre içinde kapattığı toplam genişliği elde etmek için son genişliği ilk genişlikten çıkarmaktır. Ölçülen son göç mesafesi, ayrılan süreye muhafazanın hızına ve saatteki mikrometre sayısına bölünmelidir. Anlık görüntü yöntemi, hücre göçünün daha kantitatif bir analizi, üçüncü bölüm, trans Kuyu Hücre Göçü ve İnovasyon Testi için değişen boyutlarda çok sayıda kuyuda tekrarlanabilir.

Başlamak için, önce prosedür için ilgilenilen hücreleri bir doku kültürü plakasında büyütmeniz gerekir. Daha sonra, PBS ile bir kez yıkayın ve ilgilenilen hücreleri hücre ayrışması, tampon veya tripsin ile doku kültürü plakasından ayırın. Ayrıca, tripsinin üzerinde çalıştığınız hücreleri nasıl etkileyebileceğinin arkasındaki literatürü okumanızı öneririz, çünkü kullanımı sonuçlarınızı etkileyebilir.

Beş dakika boyunca 1500 RPM'lik ayırma santrifüjünden sonra, mevcut ortamı çıkarın ve aspire edin, ardından hücreleri ve% 0.1 BSA'yı yeniden askıya alın. Transwell ekinin paketini açın ve kendi boyutu için tasarlanmış kuyuya yerleştirin. Önce Transwell invazyon testini gerçekleştiriyorsanız, ekin üstüne matrigel ekleyin ve bir sonraki adıma geçmeden önce 30 dakika inkübe edin.

Transwell zarının üzerine 100 mikrolitre hücre çözeltisi yerleştirin. Hücrelerin yerleşmesine izin vermek için 10 dakika inkübe edin. Kaplanan hücre sayısı hücre tipine bağlıdır ve daha sonraki deneylere ihtiyaç duyulabilir.

Bu sayıyı belirlemek için, istenen kemoterapi cezbedici maddeyi ekin altına kuyu dibine dikkatlice eklemek için bir pipet kullanın. Ek parçayı çıkarmamaya çalışın. Kuluçka süresi hücre tipine bağlıdır.

İnkübasyondan sonra transwell ekini çıkarın ve zarın üst kısmından zara göç etmemiş fazla ortamı ve hücreleri nazikçe çıkarmak için gerektiği kadar pamuklu uçlu bir aplikatör kullanın. Membrana zarar vermemeye dikkat edin. Boş bir alt hazneye 600 ila 1000 mikrolitre% 70 etanol ekleyin.

Ole ekini %70 etanol ile kuyuya yerleştirin ve hücre fiksasyonuna izin vermek için 10 dakika inkübe edin. Yine, zarın üst kısmından zara göç etmemiş hücrelerde kalan etanolü çıkarmak için gerektiği kadar pamuk uçlu bir aplikatör kullanın. Bir kuyucuğa 600 ila 1000 mikrolitre% 0,2'ye kadar Kristal menekşe ekleyin ve eki hücre boyama için içine yerleştirin.

10 dakika inkübe edin. Genellikle fazla kristal viyole boyayı zarın üstünden çıkarın. Daha sonra, göç eden hücrelerin yıkanmasını önlemek için çok dikkatli bir şekilde, kalan kristal menekşeyi çıkarmak için zarı gerektiği kadar damıtılmış suya batırın.

Hücreleri mikroskop kullanarak görüntülemek için zarın kurumasını bekleyin. Zar, neşter ile dikkatlice çıkarılabilir ve bir cam kapak astarı üzerine yerleştirilebilir veya ekler hala iradede olan hücreleri görüntüleyebilirsiniz. Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılarak, birkaç görüş alanının bir resmi çekilmelidir.

Taşınan hücrelerin sayısının iyi bir temsilini elde etmek için, hücre sayısı Adobe Photoshop sayma aracı kullanılarak sayılabilir. Toplanan veriler, sonuçlarınızın en iyi şekilde temsil edilmesi için bir çubuk grafiğe eklenebilir. Dördüncü bölüm, temsili sonuçlar.

Daha sonra, sizi muhafaza testinin hücre kültüründen ve transwell hücre göçü testinden elde edilen bazı temsili sonuçlardan geçireceğiz. Bu videoda açıklandığı gibi hücre motilitesini incelemek için iki ilgili yöntem, muhafaza testinin hücre kültürü ile başlayacağız. Burada 0 4 8'de 12 saat içinde çekilmiş anlık görüntüleri gösteriyoruz.

Görüldüğü gibi yara resimleri oluşturulduktan sonra çekilebilir ve zamanla yaranın kapanma mesafesi ölçülebilir. Verilerimizi bir dağılım grafiği kullanarak gösteriyoruz ve daha önce tartışılan yöntemi kullanarak zaman içinde yara kapanma hızını belirliyoruz. Ayrıca, bireysel hücre göçü, hızlandırılmış fotoğrafçılık kullanılarak ayrıntılı olarak incelenebilir.

Bu durumda, yara kapanması sırasında tek tek hücrelere yakınlaşırız, zaman içindeki göçlerini izleriz ve hareketlerini gözlemleriz Ön kenar uzantısı, kuyruk geri çekilmesi ve genel hareket gibi özellikler ayrıntılı olarak incelenebilir. Şimdi enine hücre göçü testinin bazı sonuçlarını gözden geçireceksiniz. Burada, zarın çekilmiş ve transwell hücre göçü testini takiben çekilmiş iki resmi gösteriyoruz.

İlk resim, zardan hücre göçünün çok az olduğu veya hiç olmadığı kemoatraktan olmadan sonuçları göstermektedir. İkinci resim, zara hücre göçünün arttığı kemoatraktan ile sonuçları göstermektedir. Sağ tarafta, standart hatayı temsil eden hata çubuklarına sahip bir çubuk grafik kullanarak deneyimizin niceleme sonuçlarını gösteriyoruz.

Beşinci bölüm, sonuç Transvers hücre göçü veya istilası testinde hücre kültürü muhafaza testini takiben toplanan veriler, hücrelerin 2B ortamda veya 3B ortamda göç yeteneklerini ortaya koymaktadır. Bu sonuçlar, daha önce bilinmeyen verileri potansiyel olarak ortaya çıkarmak için diğer sonuçlarla karşılaştırılabilir ve ayrıca diğer biyokimyasal testlerle de ilişkilendirilebilir. Yaygın olarak kullanılan bu iki ilgili test değerlidir ve en temel hücre biyolojisi laboratuvar kurulumları için kolayca erişilebilir.

Bugün bize katıldığınız için teşekkür eder, gelecekteki bilimsel çalışmalarınızda başarılar dileriz.