Fácil Medición de Difusión Coeficientes de etiquetado-EGFP Plasma Proteínas de la Membrana Usando k-espacio Correlación Imagen Spectroscopy

El objetivo general de este procedimiento es medir los coeficientes de difusión de las proteínas de membrana en células vivas. Esto se logra primero cultivando células que expresan la proteína marcada con GFP y luego adquiriendo una secuencia de imágenes de lapso de tiempo en un microscopio de disco giratorio con el enfoque establecido en la membrana plasmática. El segundo paso es seleccionar un recorte en la pila de imágenes en el que la membrana sea plana y no haya orgánulos móviles.

A continuación, se analiza el cultivo mediante un software de espectroscopia de correlación de imágenes basado en casos. El paso final es promediar las gráficas de difusión en Excel. En última instancia, la microscopía de células vivas combinada con kicks se utiliza para medir el coeficiente de difusión de una proteína de membrana.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biofísica de membranas, como encontrar los coeficientes de difusión de las proteínas de membrana en diferentes condiciones. La primera vez que se utilice el código kicks, abra MATLAB y haga clic en file. Luego establezca la ruta, luego haga clic en agregar con subcarpetas y busque la carpeta en la computadora en la que se encuentra el código de patadas.

Haga clic en Aceptar. Antes de guardar y cerrar MATLAB durante la adquisición, es importante mantener la membrana enfocada durante toda la duración de la imagen. Seleccione una región rectangular de interés o ROI en la parte plana de la membrana donde la fluorescencia se distribuye uniformemente.

Excluya los orgánulos celulares en movimiento y las regiones de membrana que sobresalen. El tamaño del recorte se elige de modo que se generen suficientes estadísticas para buenos gráficos de K cuadrados. Recorte la región y guarde el recorte como un tiff.

Archivo en una carpeta adecuada. Si hay varios cultivos de la misma película, use un incremento numérico como apilar un recorte, hacer tiff, apilar uno, recortar dos, tif, etcétera. Para realizar el análisis, primero abra mat lab y escriba ICS gooey en la ventana de comandos y presione enter ICS.

GUI es el nombre ejecutable del programa de interfaz gráfica de usuario de espectroscopia de correlación de imagen en el ICS Gooey. Haz clic en la pestaña patadas. Busque la carpeta con el nombre de la carpeta, código de MATLAB.

Desplácese hasta el archivo con los scripts de nombre de archivo y ábralo haciendo doble clic en él. Este archivo se llama editor. En.El editor.

Desplácese para cargar conjuntos de datos de patadas. A continuación, copie o escriba el nombre del archivo y la ubicación de la carpeta en la línea de comandos. En la línea de comandos debajo de la ubicación de la carpeta.

Establezca el número de fotogramas que se van a analizar. Utilice la misma configuración para todas las películas consecutivas de la serie de datos. Si hay desviación del enfoque en fotogramas posteriores.

Estos deben excluirse del análisis en el editor. Haga clic en Guardar y, a continuación, haga clic en Evaluar. Vender el conjunto de datos ahora se carga en el software de análisis en la ventana de análisis de kicks en la GUI.

Introduzca la configuración del análisis desmarcando primero las casillas de células T. A continuación, introduzca el número de retardos que se van a analizar. Introduzca el máximo K al cuadrado.

Suele estar entre 20 y 50 inicialmente. El análisis debe repetirse hasta que se determinen los mejores valores y, a continuación, se debe utilizar la configuración para todas las películas consecutivas de la serie de datos. Compruebe siempre que los ajustes seleccionados se ajustan bien a los datos, como lo demuestran los gráficos de buen cuadrado de casos y un gráfico de difusión lineal.

A continuación, haga clic en Configuración de la tienda y continúe. A continuación, haga clic en Sí para mostrar todos los gráficos. Haga clic en Cargar serie de imágenes y, a continuación, haga clic en Espacio de trabajo.

Seleccione el recorte de la serie de imágenes antes de hacer clic en importar desde el espacio de trabajo. Ahora ingrese la configuración de la colección del sistema de imágenes en el cuadro tamaño de píxel. Introduzca el tamaño de píxel proyectado para el sistema de imágenes en el que se adquieren las pilas de imágenes.

Haga clic en seleccionar ROI e ingrese uno. A continuación, haga clic en Aceptar y utilice la imagen completa. Haga clic en hacer análisis de patadas y haga clic en sí para realizar el filtrado inmóvil.

Los resultados se abrirán automáticamente como imágenes. Minimice la ventana de configuración, minimice la ventana de información de celda y minimice la ventana de fotofísica en la ventana de dinámica. Compruebe que el gráfico de dinámica muestra un ajuste lineal de los datos para alinearse con una pendiente negativa, lo que significa que los puntos de datos se correlacionan y se puede suponer una difusión libre.

Registre el coeficiente de difusión para los ajustes específicos de retardo de tiempo y K cuadrado. Los puntos de datos en las gráficas K al cuadrado deben agruparse alrededor de la línea durante el tiempo dado. Retrasa, guarde las figuras abiertas como imágenes y, a continuación, haga clic en Guardar figuras abiertas como imágenes para guardar los archivos de resultados.

Guarde en una nueva carpeta y, a continuación, haga clic en borrar datos actuales y continúe con el análisis del siguiente cultivo. Usando los nombres de los cultivos como se estableció anteriormente, ingrese los coeficientes de difusión individuales de cada ROI en una hoja de cálculo y asegúrese de anotar el número de retrasos de tiempo y los valores de K cuadrados. Calcule el coeficiente de difusión promedio y la desviación estándar utilizando un programa de hoja de cálculo.

Realice una prueba MOV de Smirnoff o una prueba T de estudiante para evaluar las diferencias estadísticas. Utilizando un nivel de significación del 5%, se pueden hacer comparaciones cuantitativas entre celdas. La versión de hoja de cálculo de las parcelas de difusión, que fue generada por el software de análisis para cada cultivo y el promedio de los datos para cada condición para cada desfase de tiempo.

Generar un nuevo gráfico de difusión media para su presentación en trabajos o presentaciones. Los resultados presentados aquí son una secuencia de imágenes de lapso de tiempo de Aquaporin tres marcadas con EGFP. En células MDCK vivas, que son células epiteliales renales, obstruidas en un microscopio de disco giratorio con foco fijo en la membrana plasmática.

Aquí se muestra una imagen de la celda con ejemplos de cultivos de ROI resaltados en rectángulos para la selección de cultivos. Es importante recortar en la periferia de la célula donde la membrana es uniforme y plana, por lo que solo se visualiza una difusión bidimensional. Deben evitarse los orgánulos celulares, las vesículas y las proyecciones de membrana, y es importante para el análisis que no haya deriva durante el lapso de tiempo.

Este cultivo representativo se excluyó del análisis y de las patadas ya que hay vesículas móviles, lo que puede contribuir al coeficiente de difusión. Aquí se muestra otro ejemplo de un cultivo excluido en el que hay un agujero en la membrana. Aquí se presenta el gráfico de difusión de un cultivo generado con patadas.

Este método se puede utilizar para encontrar el coeficiente de difusión de una proteína marcada con proteína fluorescente, un colorante o puntos cuánticos. La pendiente de la curva en el gráfico de difusión es simplemente el negativo del coeficiente de difusión que se muestra aquí para Aquaporin, tres marcados con EGFP que se muestran aquí es un gráfico de difusión calculado con demasiados retrasos de tiempo. En este caso, el análisis se rehizo, pero con menos desfases temporales para que el gráfico de difusión sea lineal.

Aquí se presenta un diagrama típico de caso cuadrado. Esta es la curva de correlación promediada radialmente y transformada logarítmica para un desfase de tiempo seleccionado de estos gráficos K cuadrados. La pendiente se traza en función de los desfases temporales y el resultado es el gráfico de difusión mostrado anteriormente.

Al inspeccionar las gráficas de K cuadrados, es importante que el ajuste se evalúe a partir de estas gráficas de K cuadrados. Se puede concluir que el cultivo es demasiado pequeño y no pudo ser analizado ya que debería tener una pendiente negativa y decaer linealmente a un piso de ruido. Esta gráfica de K cuadrado debe volver a analizarse con un valor máximo de K cuadrado reducido, ya que el ajuste ya no es bueno a juzgar por los residuos crecientes a valores de K cuadrado más grandes.

En este caso, el análisis debe ejecutarse de nuevo, introduciendo un valor máximo de K cuadrado inferior. Aquí se muestra una parcela de difusión promedio en 10 cultivos. La gráfica de difusión se encontró en el archivo Excel del análisis y del mismo.

El coeficiente de difusión de AQUAPORIN three EGFP se calcula siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como medir el coeficiente de difusión de las proteínas de membrana después de la adición de diferentes fármacos, para responder a preguntas adicionales como los cambios en el coeficiente de difusión después del tratamiento farmacológico y si es probable que haya cambios en los entornos lipídicos y/o en las interacciones proteína-proteína en la membrana.