イメージング細胞膜の損傷および修復に関与する細胞内プロセス

本実験の全体的な目的は、目的の処理が損傷細胞の修復に及ぼす影響を観察し、損傷細胞の修復を助ける細胞内プロセスを研究することです。これは、完全な細胞膜を通過できない蛍光染料の存在下で細胞を損傷させ、損傷細胞がこれらの染料の浸入を阻止する能力およびそのキネティクスを評価することによって達成されます。次なるステップとして、損傷した細胞膜における細胞内タンパク質の出現をモニタリングし、目的の細胞内コンパートメントが損傷細胞膜に融合することで修復に寄与する能力を特定します。

次に、損傷の速度論をモニタリングするため、標的となる細胞内コンパートメントと損傷した細胞膜との融合を観察します。このコンパートメントの誘導融合の結果、損傷した細胞表面におけるlysosome associated membrane protein 1の出現増加と、損傷細胞によるリソソーム内容物の分泌のライブイメージングに基づき、細胞膜損傷の修復がリソソームのエキソサイトーシスに関連していることが示されました。これらの手法は、細胞の損傷と修復における重要な課題を解明するのに役立ちます。

例えば、これらを用いて、細胞膜の局所的な損傷に対してどのタンパク質や細胞内コンパートメントが反応するかを特定し、その反応のキネティクスを評価することができます。本手順の実演を行うのは、私の研究室のポストドクターであるAurelia D fourとhamma stra twoです。治癒した損傷細胞と治癒しなかった損傷細胞を個別に標識します。

3つの実験条件に合わせて、細胞を滅菌済みのカバースリップに播種します。細胞が50%以上のコンフルエンスに達するまで培養し、C1とC2を37 °CのCIMで2回洗浄します。C3は37 °CのPBSで洗浄します。

次に、カバーガラスをシリコンOリング上に移動させます。適切なバッファーで予熱したfitzy dextran溶液を100 µL加えます。室温でカバーガラス上に40 mgのガラスビーズを加え、カバーを手動で傾けることで、C1およびC3の細胞膜を損傷させます。

軽度の損傷を与えるため、30度の角度で6〜8回往復させます。ガラスビーズが均一に分散していることを確認し、損傷の繰り返しを最小限に抑えることで、サンプル間の損傷の再現性を向上させます。比較対象となる異なるサンプルのガラスビーズによる損傷操作は、ビーズのさらなる転がりを避けるため、同時に行います。

すべてのカバーガラスを、周囲のCO2濃度に設定した37°Cのインキュベーターに移し、ビーズを転がさないように注意しながら、5分間修復を進行させます。バッファーまたはPBSで洗浄し、ガラスビーズとフィッツィデキストランを除去します。次に、カバーガラスをOリングの上に戻し、あらかじめ温めておいた100 µLのリシンを添加します。

固定可能なトリジーデキストラン溶液を用い、周囲のCO2条件下で37°Cで5分間インキュベートします。カバースリップをあらかじめ温めておいたCIMで2回洗浄し、PBSで2回洗浄した後、4% PFAを用いて室温で10分間固定します。Hersch染料で2分間インキュベートし、PBSで2回洗浄した後、封入剤を用いてサンプルをスライドガラスに封入します。

次に、C2サンプルを用いて、エピ蛍光顕微鏡で細胞をイメージングします。背景の赤色および緑色の染色強度を決定してください。その後、この値を閾値として、すべてのサンプルの赤色および緑色チャンネルに適用します。

緑色に染まっている細胞の総数をスコアしてください。また、CサンプルおよびC3サンプルにおいて、赤色または赤色と緑色の両方に染まっている細胞をスコアしてください。次に、各条件で緑色の損傷細胞を100個以上カウントし、修復に失敗した細胞の割合を、全損傷細胞に対するパーセントとして算出して下さい。

50%以上のコンフルエンスまで成長した細胞を、あらかじめ温めておいたCIMで洗浄し、FM色素を含むCIMを用いてカバーガラスをマウントします。37°Cに維持されたステージトップインキュベーター内のホルダーに設置してください。一貫したが致死的な影響を与えない最適な出力を用いて、細胞膜の領域を選択します。

これを達成するために、パルスレーザーを用いてサンプルを10ミリ秒未満照射します。ソフトウェアを通じてレーザー出力をピークパワーの40〜50%に減衰させ、損傷前から損傷後の3〜5分間まで、2〜10秒ごとにエピ蛍光、蛍光、および明視野でモニタリング、修復、および画像取得を行います。修復のキネティクスを定量化するために、細胞のFM色素蛍光を測定します。

イメージング過程における強度の変化を算出します。各条件で10個以上の細胞のデータを平均化し、平均値または個々の細胞の値としてプロットしてください。C oneおよびC twoのカバーガラスを洗浄します。

37 °CでCIMを用いて培養準備を行い、37 °CのPBSでC3を洗浄します。その後、サンプルをシリコンOリング上に移します。あらかじめ温めておいた100 µLのリシン固定化トリスデキストランを加えます。

先に示したように、C1およびC3の細胞質膜を損傷させます。その後、ビーズがさらに転がらないように注意しながら、すべてのカバーガラスを周囲CO2濃度の37 °Cインキュベーターに移し、5分間修復を進行させます。

次に、ガラスビーズとFicoll dextranを除去するため、カバースリップを冷たい増殖培地で洗浄します。この際、ガラスビーズが細胞上を転がらないように注意してください。カバースリップを冷たい増殖培地で2回すすぎ、OリングのC1およびC3へ移します。冷たい完全増殖培地で調製した100 µLのラット抗-US lamp 1抗体を加え、C2にも冷たい完全増殖培地を加えて抗体の結合を促します。冷たいCMで3回洗浄した後、カバースリップを4 °Cで30分間インキュベートします。

すべてのカバーガラスを4% PFAで室温にて10分間固定します。その後、CIMで3回洗浄します。次に、すべてのカバーガラスを100 µLのブロッキング溶液で15分間インキュベートし、続いて100 µLのAlexa Fluor 488抗ラット抗体で15分間インキュベートします。

PBSで2回洗浄し、さらに2回のPBS洗浄後、HER stainを用いて室温で2分間インキュベートします。サンプルをスライドにマウントし、C2細胞の画像を用いて落射型蛍光顕微鏡で撮影します。赤色および緑色チャンネルにおける非特異的なバックグラウンド染色を決定します。

これらの背景染色値を、すべてのサンプルのレッドチャンネルおよびグリーンチャンネルの閾値として使用します。C1およびC3から得られた100個以上のレッドラベル細胞を用いて、損傷細胞におけるLamp1染色の強度を測定します。実験が成功していれば、C3のLamp1染色細胞の強度は、C1の細胞よりも有意に低くなります。蛍光色素によるリソソームのラベル付けを行うには、fitc-dextranを含む増殖培地中で、コンフルエンスが50%になるまで細胞を培養し、インキュベートします。

デキストランを細胞培養インキュベーター内で2時間エンドサイトーシスさせます。あらかじめ温めておいた増殖培地で細胞を洗浄し、CO2インキュベーター内で2時間インキュベートして、イメージング前にエンドサイトーシスされたすべてのデキストランがリソソームに蓄積するようにします。カバースリップをあらかじめ温めておいたCIMで洗浄し、37 °Cのステージトップインキュベーター上のカバースリップホルダーにCIMを用いて固定します。

イメージングのために、fitzy dextranで標識されたリソソームが密集していない細胞を選択します。個々のリソソームの移動とエキソサイトーシスを観察します。細胞全体におけるリソソームの移動について、ワイドフィールド画像を撮影します。

あるいは、細胞表面での移動を確認し、エキソサイトーシスをモニターするためにターフ画像を取得します。前述のように、放射線照射によって細胞膜を損傷させ、細胞傷害に対するリソソームの反応をモニターします。目的とする細胞のエキソサイトーシスのダイナミクスに応じて、1秒あたり4〜6フレームの速度で少なくとも2分間、またはそれ以上の時間、細胞をイメージングします。このバルクアッセイでは、すべての損傷細胞が標識され、修復に失敗した細胞が特定される一方で、損傷していない細胞は未標識のままとなります。

fitzy dextran存在下でガラスビーズにより損傷を受けた細胞は、カルシウム存在下で修復させた場合に緑色に標識されます。細胞を修復させた場合、損傷した細胞のほとんどは修復に成功し、trissy dextranでは標識されません。カルシウムが存在しない場合、損傷した細胞のほとんどはtrissy dextranによって赤色に標識されます。

この実験では、細胞内へのFM色素の流入をモニタリングすることにより、細胞膜修復のキネティクスを評価します。FM色素でインキュベートした際、正常な細胞では細胞内染色はほとんど、あるいは全く見られません。細胞膜に局所的なレーザー損傷を与えると、FM色素が細胞内に入り込み内膜に結合し始めるため、FM色素の蛍光が急激に増加します。これは、レーザー損傷後の細胞膜の修復能がカルシウムに依存しているためです。

カルシウムが存在する状態で損傷を受けた細胞は修復が可能であり、これにより損傷後1分以内にFM染料の進入が停止します。対照的に、カルシウムがない状態で修復を試みた細胞は修復に失敗し、その結果、染料が進入し続け、損傷から4分後でもFM染料の蛍光が連続的に増加します。したがって、細胞膜の修復はFM染料染色のプラトー（飽和状態）へと導きます。

細胞膜の修復機能が欠如していると、染料が継続的に流入し、プラトーに達しません。バルクガラスビーズによる損傷手法を用いることで、損傷に応答した小胞やタンパク質の細胞表面への転移をモニタリングすることができます。ここでは、トリシィデキストラン存在下で細胞に損傷を与えます。

したがって、損傷していない細胞は赤色に標識されませんが、損傷したすべての細胞は赤色に標識されます。なお、一次抗体で処理されていない未損傷の細胞では、細胞表面のLAMP1の標識はバックグラウンドレベルであることをに留意してください。しかし、細胞が損傷し、カルシウム存在下で回復させると、リソソームがエキソサイトーシスを起こすため、損傷した細胞の表面でLAMP1の染色のレベルが上昇します。

この細胞表面におけるLamp1標識の増加は、カルシウム不在下で治癒させた細胞では大幅に低くなります。したがって、細胞表面のLamp1染色の強度が強い細胞の数を定量すること、および損傷を受けた個々の細胞における細胞表面のLamp1染色のレベルを測定することの両方が、損傷によって誘発されるリソソームエキソサイトーシスを行う細胞能力の指標となります。

この実験では、個々のリソソーム融合のキネティクス、性質、および場所を直接的にモニタリングします。細胞膜損傷への応答として、パルスレーザーで細胞を損傷させ、細胞表面のリソソームをTurfイメージングで撮影することで、個々の細胞における損傷誘発性リソソームエキソサイトーシスのモニタリングが可能になります。この図では、左パネルに位相差イメージング、中央パネルにTurf顕微鏡法で可視化した細胞を示しています。

右側のパネルは、損傷から105秒後の同一細胞のターフ画像を示しています。ここでは、損傷によってリソソームが細胞膜へリクルートされ、それに続いてエキソサイトーシスが起こる様子が示されています。このリソソームは、損傷前のターフ画像では見えませんが、損傷後に細胞膜に到達し、検出可能になります。

小胞が細胞膜に近づくにつれ、TURF照明による励起が強まり、リソソーム内のfitzy DExTストランドの蛍光が最大値に達します。融合孔が開くと、リソソーム内のpHが中和され、それによってfitzy DExTストランドの蛍光の消光が解除されます。続いて、DExTストランドが小胞から細胞外へ放出されるため、ZI蛍光が側方に拡散し、小胞の蛍光が徐々に減少します。これにより、リソソームのさまざまな損傷誘発反応を測定することが可能です。

このビデオを視聴することで、細胞が大きな局所的損傷から回復する能力をモニタリングする方法、および修復プロセスに反応し、それを促進する細胞内コンパートメントやタンパク質をモニタリングする方法について十分に理解できるはずです。さらに、異なるタグを用いたバイタルラベル標識、コンパートメント、またはタンパク質を用いた実験を行うことで、損傷への反応やIND細胞の修復への関与をモニタリングすることが可能です。