Изображений Клеточная мембрана Травмы и субклеточных процессов, связанных с Ремонт

Общая цель следующего эксперимента — наблюдать за влиянием выбранных методов обработки на восстановление поврежденных клеток и изучить субклеточные процессы, способствующие этому восстановлению. Это достигается путем повреждения клеток в присутствии флуоресцентных красителей, которые не способны проникать через неповрежденные клеточные мембраны, что позволяет оценить кинетику и способность поврежденных клеток предотвращать проникновение этих красителей. На втором этапе мы отслеживаем появление внутриклеточных белков на поврежденной клеточной мембране, что позволяет определить способность интересующего клеточного компартмента участвовать в восстановлении путем слияния с поврежденной мембраной клетки.

Затем мы отслеживаем слияние интересующих нас клеточных компартментов с поврежденной клеточной мембраной, чтобы изучить кинетику повреждения. Результаты индуцированного слияния этих компартментов показывают, что восстановление поврежденной клеточной мембраны связано с лизосомальным экзоцитозом, что подтверждается усилением появления белка ассоциированного с лизосомальной мембраной 1 на поверхности поврежденной клетки, а также данными прижизненной визуализации секреции содержимого лизосом поврежденными клетками. Данные методы позволяют ответить на важные вопросы, касающиеся повреждения и восстановления клеток.

Например, этот метод можно использовать для определения того, какие белки и клеточные компартменты реагируют на фокальные повреждения клеточной мембраны, с последующей оценкой кинетики этого ответа. Процедуру продемонстрируют Аурелия D four и hamma stra two, постдокторанты моей лаборатории, которые проведут раздельное маркирование поврежденных клеток, восстановившихся и не восстановившихся.

Рассейте клетки на стерильных покровных стеклах для трех экспериментальных условий. Культивируйте клетки до достижения конфлюэнтности более 50%, затем дважды промойте образцы C one и C two средой CIM при 37 °C. Промойте образец C3 раствором PBS при 37 °C.

Затем перенесите покровные стекла на силиконовые уплотнительные кольца. Добавьте 100 µL предварительно нагретого раствора фицци-декстрана в соответствующем буфере. Создайте повреждения плазматической мембраны на C1 и C3, добавив 40 мг стеклянных шариков на покровное стекло при комнатной температуре и вручную наклонив стекло.

При легком повреждении перемещайте образец вперед-назад от шести до восьми раз под углом 30 градусов. Убедитесь, что стеклянные шарики распределены равномерно, чтобы минимизировать повторные повреждения и повысить воспроизводимость травматизации между образцами. Выполняйте повреждение стеклянными шариками для всех сравниваемых образцов одновременно, чтобы избежать дополнительного перекатывания шариков.

Перенесите все покровные стекла в инкубатор при температуре 37 °C и атмосферном содержании CO2; дайте процессу восстановления протекать в течение пяти минут, не допуская перекатывания бусин. Удалите стеклянные бусины и Фитци-декстран, промыв образцы буфером или PBS. Затем снова поместите покровные стекла на O-кольцо и добавьте 100 µL предварительно нагретого лизина.

Раствор фиксируемого тризи-декстрана. Инкубируйте при 37 °C в течение пяти минут при атмосферном содержании CO2. Промойте покровные стекла дважды предварительно нагретым CIM и зафиксируйте 4% PFA в течение 10 минут при комнатной температуре после двух промывок PBS. Инкубируйте в течение двух минут с красителем Херша, а затем, после двух промывок PBS, закрепите образец на предметном стекле, используя среду для заключения.

Затем выполните визуализацию клеток с помощью эпифлуоресцентного микроскопа, используя образец C two. Определите интенсивность фонового красного и зеленого окрашивания. Затем используйте это значение для установки порога интенсивности красного и зеленого каналов для всех образцов.

Подсчитайте общее количество зеленых клеток. Также подсчитайте клетки, которые окрашены в красный цвет или одновременно в красный и зеленый в образцах C1 и C3. Затем подсчитайте более 100 поврежденных зеленых клеток для каждого условия и выразите долю клеток, в которых восстановление не произошло, в процентах от общего числа поврежденных клеток.

Промойте клетки, достигшие более 50% конфлюэнтности, предварительно нагретым CIM и закрепите покровное стекло в CIM с красителем FM. Поместите образец в держатель в предметном инкубаторе при температуре 37 °C. Выберите область клеточной мембраны, используя оптимальную мощность, которая обеспечивает стабильное, но нелетальное повреждение.

Для достижения этого облучайте образец импульсным лазером в течение менее 10 миллисекунд. С помощью программного обеспечения снизьте мощность лазера до 40–50% от пиковой мощности, чтобы осуществлять мониторинг, восстанавливать и получать изображения каждые 2–10 секунд в режимах эпи-флуоресценции и светлого поля, начиная до нанесения повреждения и продолжая в течение трех-пяти минут после него. Для количественной оценки кинетики восстановления измерьте флуоресценцию клеточного красителя FM.

Рассчитайте изменение интенсивности в процессе визуализации. Вычислите среднее значение данных для более чем 10 клеток в каждом варианте и постройте график в виде средних значений или значений для отдельных клеток. Промойте покровные стекла C one и C two.

Подготовьте культуры с CIM при 37 °C и промойте C3 буфером PBS при 37 °C. Затем перенесите образцы на силиконовые уплотнительные кольца. Добавьте 100 µL предварительно нагретого фиксирующего лизин-трис-декстрана.

Повредите плазматическую мембрану на C1 и C3, как показано ранее. Затем, стараясь не допустить дальнейшего перекатывания бусин, перенесите все покровные стекла в инкубатор при температуре 37 °C и атмосферном содержании CO2 и оставьте для восстановления на пять минут.

Теперь, чтобы удалить стеклянные микросферы и декстран Trixie, промойте покровные стекла в холодном ростовой среде, не допуская перекатывания микросфер по клеткам. Дважды промойте покровные стекла холодной ростовой средой и перенесите их в О-кольца C1 и C3. Добавьте 100 µL антител кролика к US lamp one в холодную полную ростовую среду и добавьте холодную полную ростовую среду в C2 для связывания антител. Инкубируйте покровные стекла в течение 30 минут при 4 °C после трех промывок холодной CIM.

Зафиксируйте все покровные стекла 4% PFA в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем трижды промойте их CIM. Далее инкубируйте все покровные стекла в 100 мкл блокирующего раствора в течение 15 минут, после чего добавьте 100 мкл антител anti rat 488 на 15 минут.

Дважды промойте образцы PBS, затем после еще двух промывок PBS инкубируйте их в красителе her в течение двух минут при комнатной температуре. Закрепите образцы на предметном стекле, после чего выполните визуализацию клеток C two с помощью эпифлуоресцентного микроскопа. Определите уровень неспецифического фонового окрашивания в красном и зеленом каналах.

Используйте эти значения фонового окрашивания для установления порога красного и зеленого каналов для всех образцов. Используйте более 100 клеток с красной меткой из C1 и C3 для измерения интенсивности окрашивания Lamp1 в поврежденных клетках. При успешном проведении эксперимента интенсивность окрашивания Lamp1 в клетках C3 будет значительно ниже, чем в клетках C1. Для маркировки лизосом флуоресцентным красителем инкубируйте клетки, выращенные до 50% конфлюэнтности, в ростовой среде, содержащей FITC-декстран.

Оставьте декстран для эндоцитоза на два часа в инкубаторе для культур клеток. Промойте клетки предварительно нагретой ростовой средой и инкубируйте в ней в течение двух часов в CO2-инкубаторе, чтобы весь эндоцитозированый декстран накопился в лизосомах перед визуализацией. Промойте покровное стекло предварительно нагретым CIM и закрепите его в CIM в держателе для покровных стекол в инкубаторе на предметном столике при температуре 37 °C.

Выберите клетки, в которых нет плотных скоплений лизосом, меченных fitzy-декстраном, для проведения визуализации. Проследите за перемещением и экзоцитозом отдельных лизосом. Получите широкопольные изображения для анализа перемещения лизосом по всей клетке.

В качестве альтернативы снимите изображения турф для анализа их перемещения по поверхности клетки и мониторинга экзоцитоза. Для отслеживания реакции лизосом на повреждение клетки воздействуйте на клеточную мембрану облучением, как показано ранее; снимайте изображения клеток со скоростью от четырех до шести кадров в секунду в течение как минимум двух минут или дольше, в зависимости от динамики экзоцитоза в исследуемых клетках. В этом групповом анализе все поврежденные клетки будут помечены, и те из них, в которых восстановление не произошло, будут идентифицированы, в то время как неповрежденные клетки останутся немаркированными.

Клетки, поврежденные стеклянными шариками в присутствии фитци-декстрана, окрашиваются в зеленый цвет, если им дать возможность восстановиться в присутствии кальция. Большинству поврежденных клеток удается восстановиться, и они не метятся трисси-декстраном при обеспечении условий для репарации. В отсутствие кальция большинство поврежденных клеток также окрашиваются в красный цвет трисси-декстраном.

В данном эксперименте оценивается кинетика восстановления клеточной мембраны путем мониторинга проникновения красителя FM в клетку. При инкубации с красителем FM интактные клетки практически не проявляют внутриклеточного окрашивания. После локального лазерного повреждения клеточной мембраны краситель FM начинает проникать в клетку и связываться с эндомембранами, что вызывает резкое увеличение флуоресценции красителя FM, так как способность клеточной мембраны к восстановлению после лазерного повреждения зависит от кальция.

Клетка, поврежденная в присутствии кальция, способна к восстановлению, что приводит к прекращению проникновения красителя FM в течение минуты после повреждения. Напротив, клетка, которой было позволено восстанавливаться в отсутствие кальция, не восстанавливается, что приводит к непрерывному проникновению красителя и, следовательно, к постоянному усилению флуоресценции FM даже спустя четыре минуты после повреждения. Таким образом, восстановление клеточной мембраны приводит к выходу окрашивания красителем FM на плато.

В то время как отсутствие восстановления клеточной мембраны приводит к непрерывному проникновению красителя без выхода на плато, метод повреждения массивными стеклянными микросферами может быть использован для мониторинга транслокации везикул и белков к поверхности клетки в ответ на повреждение. В данном случае повреждение клеток проводится в присутствии тризи-декстрана.

Таким образом, в то время как неповрежденные клетки не окрашиваются в красный цвет, все поврежденные клетки окрашены в красный. Обратите внимание, что неповрежденные клетки, не обработанные первичным антителом, демонстрируют фоновый уровень окрашивания lamp one на поверхности клеток. Однако при повреждении клеток и их последующем заживлении в присутствии кальция лизосомы подвергаются экзоцитозу, что приводит к повышению уровня окрашивания lamp one на поверхности поврежденных клеток.

Это увеличение маркировки LAMP1 на поверхности клеток выражено гораздо слабее в клетках, которым дали восстановиться в отсутствие кальция. Таким образом, как количественная оценка числа клеток с интенсивным окрашиванием LAMP1 на поверхности, так и измерение уровня окрашивания LAMP1 на поверхности отдельных поврежденных клеток позволяют оценить способность клеток к повреждению, инициирующему лизосомальный экзоцитоз.

В данном эксперименте непосредственно отслеживаются кинетика, характер и локализация слияния отдельных лизосом. В ответ на повреждение клеточной мембраны клетки подвергаются воздействию импульсного лазера, а лизосомы на поверхности клеток визуализируются с помощью метода turf-имиджинга, что позволяет контролировать индуцированный повреждением экзоцитоз лизосом в отдельных клетках. На этом рисунке представлена клетка, визуализированная методом фазово-контрастной микроскопии на левой панели и с помощью turf-микроскопии на средней панели.

На правой панели представлено изображение клетки, полученное методом turf, через 105 секунд после повреждения. Здесь показано, что повреждение вызвало перемещение лизосомы к клеточной мембране с последующим экзоцитозом. Эта лизосома не видна на turf-изображении до повреждения, но после него лизосома достигает клеточной мембраны и становится заметной.

По мере приближения везикулы к клеточной мембране она подвергается более интенсивному воздействию освещения зоны возбуждения, что приводит к достижению максимального значения флуоресценции лизосомальной нити fitzy dex. При открытии поры слияния происходит нейтрализация pH лизосомы и, следовательно, деквенчинг флуоресценции нити fitzy DExT. Впоследствии нить DExT высвобождается из везикулы во внеклеточную среду, что вызывает латеральное распространение флуоресценции ZI и постепенное снижение флуоресценции везикулы; таким образом, можно измерить различные ответы лизосом, вызванные повреждением.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как контролировать способность клеток к восстановлению после обширных фокальных повреждений, а также отслеживать субклеточные компартменты и белки, которые реагируют на процесс восстановления и способствуют ему. Для мониторинга реакции на повреждение и участия в восстановлении клеток IND могут быть проведены дополнительные эксперименты с использованием различных витальных меток, других компартментов или белков.