Sintesi di una proteina artificiale mediata da inteina Hydrogel

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di sintetizzare un idrogel proteico altamente stabile che possa essere utilizzato come impalcatura generale per l'immobilizzazione delle proteine. Ciò si ottiene sintetizzando prima due blocchi costitutivi di idrogel proteico in un ospite batterico. Ogni blocco contiene una subunità di una proteina chimerica che funge da reticolante e metà dell'ene diviso NPU.

Queste proteine vengono poi purificate mediante cromatografia di affinità nella seconda fase. I mattoni proteici purificati vengono mescolati dando inizio a reazioni di transsplicing adolescenziale che ricostituiscono un polipeptide autoassemblante fiancheggiato da reticolanti che innescano la formazione di idrogel. Questo idrogel è altamente stabile nell'incorporazione in soluzione di un motivo di legame appropriato nel blocco proteico.

I copolimeri consentono l'incorporazione sito-specifica di proteine gulari funzionali nei blocchi costitutivi dell'idrogel, con conseguente formazione di un idrogel, che immobilizza le proteine gulari immobilizzate mostrano un basso tasso di lisciviazione nell'arco di tre settimane a temperatura ambiente. Infine, gli enzimi immobilizzati in questo idrogel proteico sono protetti dalla denaturazione da solventi organici. Pertanto, questo idrogel può anche fungere da bioreattore per la sintesi organica.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti per l'immobilizzazione stabile delle proteine, compresi quelli che coinvolgono la reticolazione LI di superficie o l'incapsulamento di enzimi in supporti porosi o la reticolazione interenzimatica, è la capacità di immobilizzare stabilmente le proteine bersaglio in un ambiente poroso e altamente idratato senza alcuna modifica chimica della catena laterale proteica. Questa tecnologia consente anche l'assemblaggio di più enzimi all'interno di un percorso in una disposizione tridimensionale predeterminata che può facilitare la canalizzazione del substrato tra gli enzimi. Prima di iniziare questa procedura, generare i due copolimeri a blocchi proteici N e C tramite la costruzione di plasmidi mediante tecnologie di DNA ricombinante seguite dall'espressione proteica e REIA coli B 21 de tre per purificare e risospendere i pellet cellulari nel tampone A a 10 millilitri per grammo di pellet umido.

Quindi immergere la sospensione del pellet in un bagno di acqua ghiacciata e distruggere le celle mediante sonicazione a 10 ampere con un impulso di un secondo e una pausa di sei secondi per un minuto al termine. Centrifugare il lisato a 6.000 volte G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver rimosso la provetta dalla centrifuga, scartare il surnatante S e risospendere il pellet nel tampone DA dopo la centrifugazione utilizzando le stesse condizioni di prima, facendo passare il surnatante attraverso una colonna NTA da cinque millilitri precedentemente bilanciata con tampone DA utilizzando un sistema cromatografico a bassa pressione.

Quindi lavare la colonna con 30 millilitri di tampone DA integrato con 45 millimolare di ole eluito, la proteina purificata utilizzando 20 millilitri di tampone DA integrato con 150 millimolari di ole. Trasferire la proteina purificata in una provetta da centrifuga contenente una colonna di centrifuga per ultrafiltrazione da 30 kilodalton. Centrifugare il campione a 2, 800 volte G e quattro gradi Celsius fino a quando il volume è inferiore a un millilitro.

Al termine, aggiungere 14 millilitri di tampone DPBS alla colonna per diluire il campione proteico. Ripetere le fasi di centrifugazione e diluizione altre tre volte dopo lo scambio del tampone, aggiungere DTT alla proteina purificata per ottenere una concentrazione finale di due millimolari. Successivamente, concentrare la proteina a circa 100 milligrammi per millilitro mediante centrifugazione attraverso una colonna di centrifugazione di ultrafiltrazione da 30 kilodalton a 2.800 volte G a quattro gradi Celsius per circa 45 minuti a un'ora.

Per preparare una miscela di idrogel da 100 microlitri, 42 microlitri di una soluzione madre di C da 100 milligrammi per millilitro con 10 microlitri di sodio azide al 5%, cinque microlitri di DTT da 100 millimolari e 42 microlitri di una soluzione madre da 100 milligrammi per millilitro di N.In un flaconcino di vetro da due millilitri, aggiungere un microlitro di tampone DPBS al flaconcino per ottenere un volume finale di 100 microlitri e miscelare manualmente tutti i componenti tramite un movimento vorticoso utilizzando una punta per pipetta. Dopo la centrifusione della miscela per due minuti a 8.000 volte G, incubarla a temperatura ambiente per una notte per consentire il completamento della reazione di transsplicing ENE. Successivamente, confermare la formazione di idrogel capovolgendo il tubo per ottenere 50 microlitri di un idrogel funzionalizzato GFP da 1,2 millimolari.

Combinare 17 microlitri da una soluzione madre contenente 100 milligrammi per millilitro di CSH tre ligandi e nove microlitri di una soluzione da 230 milligrammi per millilitro di SH 3G FP in un rapporto molare uno a uno in una provetta da centrifuga da 1,7 millilitri e incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi, aggiungere cinque microlitri di sodio azide al 5%, 2,5 microlitri di DTT da 100 millimolari e 0,5 microlitri di DPBS allo stesso tubo. Quindi aggiungere 16 microlitri di N per ottenere un rapporto molare uno a uno di N e tre ligandi CSH e mescolare il campione con un movimento vorticoso utilizzando una punta di pipetta, centrifugare la miscela a 8.000 volte G per due minuti.

Al termine, incubare la miscela a temperatura ambiente per una notte al buio per formare un idrogel e incapsulare SH 3G FP. Per un'ulteriore applicazione, preparare una soluzione madre 0,63 millimolari di perossidasi di rafano HRP in DPBS per ottenere 30 microlitri di un idrogel da 1,6 millimolari e intrappolare HRP combinato 12 microlitri di una soluzione madre da 100 milligrammi per millilitro di C con due microlitri di HRP, tre microlitri di azoturo di sodio al 5% e 0,5 microlitri di DTT da 300 millimolari e una provetta da centrifuga da 1,7 millilitri. Aggiungere 12 microlitri di una soluzione di N da 100 milligrammi per millilitro e 0,5 microlitri di DPBS e mescolare la soluzione con un movimento vorticoso utilizzando una punta IPE. Dopo la centrifusione della miscela a 8.000 volte G per due minuti, incubarla a temperatura ambiente per una notte.

Per la reazione enzimatica, immergere l'idrogel in un millilitro di un cocktail di reazione contenente 5,8 millimolari di NN dimetil PPH fenolo diammina, 5,8 millimolari di fenolo e 2,9 millimolari di turt butile idro perossido in n eptano interrompere manualmente il gel utilizzando una punta di pipetta per aumentare la superficie di contatto dell'idrogel e del solvente. Rilevare il prodotto HRP e il colorante di tipo indelfenolo prelevando campioni del solvente in tempi diversi e misurando l'assorbanza ottica a 546 nanometri in un lettore di piastre miscelando N e C purificati in presenza dell'agente riducente, DTT induce la formazione di una terza proteina, il prodotto legato J individualmente. Gli elementi costitutivi dell'idrogel n NC esistono come fluidi viscosi che mescolano n NC producono un materiale semisolido trasparente che viene trattenuto sul fondo di una fiala di vetro dopo l'inversione indicativa della formazione di un idrogel.

Questo idrogel proteico mediato da ene mostra un'elevata stabilità in soluzione. C'è poca o nessuna perdita di scaffold in idrogel reticolato dopo 21 giorni a 22 gradi Celsius nel tampone DPBS. Poiché la quantità totale di proteina rilasciata nel tampone DPBS supera solo leggermente la quantità teorica dell'ene spliced dall'idrogel, la citometria densa ha rivelato che durante la formazione dell'idrogel, le reazioni di trans splicing erano efficienti di circa l'80%.

L'analisi del gel della pagina SDS ha mostrato che solo tracce del prodotto trans spliced erano presenti nel tampone circostante l'idrogel. A conferma che la perdita dell'impalcatura in idrogel reticolato a causa dell'erosione è minima. La principale proteina presente nell'idrogel che circonda il tampone è l'intune giuntato.

Non sono stati osservati segni visibili di erosione in un idrogel indisturbato, immerso in una soluzione acquosa a temperatura ambiente per oltre tre mesi. L'idrogel è anche altamente stabile a 37 gradi Celsius e in tamponi acidi e basici. Per facilitare l'immobilizzazione delle proteine, una proteina e il suo ligando peptidico sono stati utilizzati per agganciare le proteine di interesse nell'impalcatura dell'idrogel.

Abbiamo scelto la proteina SH tre, un dominio di omologia SAR tre dalla proteina adattatore CRK come proteina di aggancio per la fusione con una proteina di interesse e il suo ligando come peptide della stazione di aggancio per l'incorporazione nell'impalcatura dell'idrogel. Questa coppia di interazioni è stata scelta a causa delle dimensioni molecolari relativamente piccole e dell'elevata finità di affinità. Il triligante SH è stato inserito tra la NPUC e il taglio A per formare il triligando CSH.

La proteina S SH 3 è stata fusa all'estremità terminale di un modello di proteina globulare bersaglio GFP. Il processo descritto nel protocollo produce un idrogel contenente 1,2 millimolari di blocchi di base della spina dorsale di idrogel trans spliced e 1,2 millimolari di GFP. La GFP contenente idrogel ha mostrato una stabilità simile all'idrogel privo di GFP con circa il 35% di perdita totale di proteine dopo 21 giorni.

Nel tampone DPBS, la maggior parte delle proteine presenti nel tampone di erosione sono state scisse negli adolescenti. La lisciviazione di SH 3G FP da un idrogel contenente il ligando S SH tre è di circa il 30% dopo tre settimane, significativamente più piccola di quella di un idrogel privo del ligando s sh tre come si vede qui idrogel contenente il peptide della docking station. Il triligante S SH conserva la maggior parte della fluorescenza GFP.

Dopo tre settimane, mentre l'idrogel privo di SSH tre ligando diventa essenzialmente non fluorescente. La densità della GFP immobilizzata in questo lavoro è di circa il 33% molare dell'idrogel. Una maggiore densità di immobilizzazione può potenzialmente essere raggiunta quando più peptidi della docking station sono incorporati nel blocco costitutivo dell'idrogel.

Successivamente, l'enzima HRP è stato incorporato nell'idrogel proteico per dimostrare la sua capacità di supportare i biocatalizzatori nei solventi organici. L'attività enzimatica è stata misurata monitorando l'accoppiamento ossidativo di NN dimetil pph, Lene diammina e fenolo con il perossido di butile idro di turt nel tempo. L'ipotesi era che l'ambiente idratato dell'idrogel proteggesse l'enzima attaccato dall'effetto denaturante del solvente organico.

Dopo aver immerso un solvente organico, l'HRP contenente idrogel è stato disgregato manualmente in piccoli cluster per aumentare l'area di interfaccia idrofobica idrofila. L'HRP incorporato nell'idrogel ha catalizzato efficacemente la rapida reazione di ossidazione dando origine a un prodotto colorimetrico. L'accumulo del prodotto segue una pendenza lineare che indica poca o nessuna attivazione dell'enzima.

Durante l'esperimento, l'HRP ha disciolto prima A-D-P-B-S seguito dall'aggiunta al solvente organico, è stato in grado di catalizzare la conversione, ma ad una velocità di reazione molto ridotta. Il basso tasso di conversione degli enzimi disciolti nella DPBS è probabilmente dovuto alla piccola area interfacciale tra la DPBS e il solvente organico, che limita la velocità di diffusione del prodotto del substrato. L'incorporazione del frammento s altamente idrofilo nella spina dorsale dell'idrogel, che blocca efficacemente l'acqua all'interno dell'idrogel e impedisce al solvente organico di accedere all'interno dell'idrogel, consente all'idrogel di resistere all'effetto denaturante del solvente organico.

Questi risultati indicano che l'idrogel proteico mediato da ene può essere un'impalcatura efficace per le reazioni enzimatiche in solventi organici. La flessibilità strutturale e l'elevata stabilità di questo idrogel autoassemblante ne consentono l'utilizzo non solo nelle proteine e nella mobilizzazione, ma anche in altre applicazioni, tra cui celle a biocombustibile, vettori iniettabili per la somministrazione di farmaci e scaffold per l'ingegneria tissutale.