Dimostrazione di un multi-resistente ai farmaci Mycobacterium tuberculosis Amplificazione Microarray

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di genotipizzare il microbatterio tubercolosis multiresistente ai farmaci, utilizzando un microarray di amplificazione. Ciò si ottiene eseguendo una PCR asimmetrica multiplex sulla parte superiore di un microarray all'interno di una singola camera di reazione microfluidica. Lì il campione viene amplificato simultaneamente, etichettato per la dimensione, reso a singolo filamento e ibridato al microarray.

Successivamente, dopo che il microarray è stato lavato, un lettore mostra se è presente il microbatterio tubercolosi e se contiene una mutazione del DNA nota per conferire resistenza alla rifampicina iso, al niazi etambutolo o alla streptomicina. Il vantaggio di questo metodo rispetto ai metodi esistenti di ibridazione con sonda a linea di microarray o acido nucleico è che un microarray di amplificazione semplifica significativamente l'interazione dell'utente con il test. Tuttavia, pur fornendo la sensibilità analitica della PCR e la capacità di multiplexing di un microarray Per questa procedura, avere uno spazio di lavoro pulito pulito pulito con una soluzione decontaminante e avere acidi nucleici sufficientemente puri per la PCR multiplex.

Dopo aver scongelato e mescolato tutte le soluzioni stock, assemblare la miscela master PCR. Quando si prepara questa miscela, preparare almeno un volume extra di miscela per il test della tubercolosi mostrato qui. Inoltre, aggiungi extra T polimerasi alla miscela master.

Oltre alla quantità di tack fornita con i reagenti stock, miscelare un'aliquota di microlitro di DNA campione con 49 microlitri di master mix. Aggiungere con cautela 48 microlitri di ciascuna miscela di reazione al centro del microarray appropriato. Non toccare il microarray stesso.

Quindi coprire e sigillare accuratamente il microarray in modo improprio. L'applicazione del vetrino coprioggetti può introdurre bolle che possono portare ad artefatti, evaporazione, scarsa amplificazione o ibridazione non uniforme. Ognuna di queste condizioni può portare a un risultato errato.

Quindi, caricare il micro tasso nel termociclatore. Con i substrati contro il blocco termico, l'opzione del coperchio riscaldato deve essere disattivata. Per i laboratori che seguono le precauzioni universali della PCR, è più efficiente includere diversi microarray di amplificazione per vetrino ed elaborare più test contemporaneamente.

Ora, eseguire il programma di cicli termici appropriato. Questo programma ha 50 cicli di amplificazione, che possono sembrare elevati ma necessari a causa della popolazione di amplicone prevalentemente a singolo filamento creata dalla reazione. Al termine della reazione, rimuovere i microarray e spegnere il termociclatore.

Aprire con cautela la camera del microarray con il piatto e la pinza. Rimuovere lo slittamento, il coperchio e la guarnizione. Il microarray può essere danneggiato da questo passaggio, quindi fai attenzione in modo improprio.

La rimozione del gruppo guarnizione può causare danni fisici al microarray. Fare attenzione a non piegare o flettere il vetrino coprioggetto e fare molta attenzione per evitare di graffiare la superficie del microarray con la pinza, ora trasferire i substrati del microarray su un supporto per vetrini istologici. Immergere i substrati nel tampone di lavaggio per 10 minuti a temperatura ambiente con una leggera agitazione, seguire il bagno di soluzione di lavaggio con altri due o tre lavaggi, il tutto in acqua deionizzata.

Asciugare i microarray prima di procedere con l'imaging. A questo scopo è possibile utilizzare un leggero flusso di aria compressa in questa dimostrazione, i parametri sono specifici per il test MDR TB e un imager portatile da campo Econ DX 2100. Una luce blu sulla termocamera indica che è pronta.

Accendere il computer. Aprire il software di sistema fornito da un conni e attendere che il software annunci di aver stabilito una connessione con la fotocamera. Quindi, inserire il microarray essiccato nell'imager.

Con il microarray rivolto verso l'obiettivo e lontano dall'utente. Il software fornirà ora un'immagine di anteprima dal menu a discesa. Selezionare lo script di analisi MDR TB.

Immettere un tempo di esposizione compreso tra 100 e 500 millisecondi. Verranno letti i pixel sovraesposti. Regola l'esposizione per ridurli al minimo.

Quando la saturazione è impostata per ridurre al minimo la sovraesposizione, avviare l'analisi. Il software posiziona una griglia MDRT TB sui punteggi delle immagini, sui campioni e sulle intensità di fondo, quindi riporta i risultati della resistenza ai farmaci e della genotipizzazione. Una volta completata l'analisi e salvata, rimuovere il chip dall'imager e avviare una nuova sessione di analisi per analizzare l'array successivo.

Continuare l'analisi per ciascuno dei microarray elaborati. Salvataggio dei dati ogni volta. L'analisi qualitativa delle immagini può fornire informazioni sulle fonti di rumore sperimentale o sulla variabilità che è difficile da identificare nelle tabelle di dati generate dal software di analisi automatizzata delle immagini.

Qui si vede una matrice di alta qualità priva di artefatti. Diversi artefatti possono portare all'introduzione di bolle che creano aloni. Nonostante gli artefatti dell'array, il software recupererà comunque i valori dalla scansione.

Un algoritmo di segnalazione diagnostica, nonostante l'ottenimento di valori, riconoscerebbe questa matrice come non valida. Una serie di diluizione del DNA genomico wild type H 37 RA è stata utilizzata su un modello di PCR microarray a 6,25 picogrammi, l'equivalente di 1.250 cellule. Tutte le sonde sono state rilevate.

Un valore SNR superiore a tre è un risultato positivo e i valori registrati erano molto più alti. Successivamente, sono stati genotipizzati gli isolati di riferimento dell'Organizzazione Mondiale della Sanità. I polimorfismi a singolo nucleotide presenti sull'array sono stati rilevati come mutazione corrispondente nel genoma MDR TB.

Erano evidenti anche diversi esempi di rilevamento di mutazioni vicine vicine. Una discussione è fornita nel protocollo di testo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa tre ore e mezza o sei ore e mezza, a seconda della concentrazione di DNA, del test specifico, dell'efficienza e dell'uniformità del termociclatore e della sensibilità e specificità analitica o clinica desiderata.

Inoltre, il numero di cicli di amplificazione e i tempi di ibridazione post-amplificazione possono essere facilmente ridotti o allungati per ottenere le caratteristiche prestazionali desiderate.