Name: 相关的mRNA分离与酵母线粒体研究本地化翻译的机制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-14T17:50:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: 学习从酵母细胞中分离线粒体及其相关翻译mRNA的方法。该技术通过差速离心分离细胞组分，提取高质量RNA用于Northern分析，为研究线粒体定位翻译机制提供可靠方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢 Erez Eliyahu、Daniel Melamed、Ophry Pines 和 Doron Rapaport 博士在本方案建立过程中提供的帮助和意见。本工作由以色列科学基金（ISF）资助（资助号 1193/09）。

1. 线粒体纯化
称量细胞沉淀。从100 ml细胞中大约可获得0.6 g。
<ol>
	<li>将酵母细胞培养至 OD 100-150 ml600 = 1-1.5（30 时） 在非发酵性生长培养基（如基于半乳糖的生长培养基）中于°C培养，以富集线粒体。</li>
	<li>在室温下以 3,000 x g 离心细胞 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用双蒸水洗涤沉淀，再次离心。弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于每0.5 g细胞加入1 ml DTT缓冲液中。使用还原剂处理细胞至关重要，以断裂细胞壁内的二硫键，从而提高水解效率。</li>
	<li>将细胞在30℃孵育10分钟 在温和振荡条件下，于°C下孵育。同时，按每1 g细胞称取6 mg的zymolyase，溶于Zymolyase缓冲液中。</li>
	<li>在室温下以 3,000 x g 离心细胞 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于每0.15 g细胞加入1 ml Zymolyase缓冲液中。切勿涡旋。</li>
	<li>测量 OD600 10 μl 细胞样品与 990 μl 水混合。</li>
	<li>加入Zymolyase（步骤1.5）处理细胞，以水解β-1,3-葡聚糖连接处的葡萄糖聚合物，生成原生质球。从本步骤开始，原生质球应始终置于等渗溶液中，以防止裂解。</li>
	<li>在30 °C下轻轻振荡孵育细胞15分钟（以保证zymolyase的最佳活性）。为验证细胞壁的水解及原生质球的形成，取10 μl细胞悬液与990 μl水混合。由于渗透压差异，原生质球应发生裂解，OD600 应至少比步骤1.9中确定的值低10倍。若未达到，继续用zymolyase孵育额外15分钟。</li>
	<li>在室温下以 3,000 x g 离心 5 分钟。小心弃去上清液，因为沉淀物可能不稳定。</li>
	<li>用Zymolyase缓冲液洗涤原生质球，并弃去上清液。</li>
	<li>用100 ml复苏培养基重悬原生质球，将原生质球转移至锥形瓶中，在30 °C下孵育1小时 °C下振荡培养。此恢复步骤是必要的，因为在Zymolyase处理期间，翻译过程被抑制，且mRNA的定位受到破坏（图1B).</li>
	<li>加入0.1 mg/ml CHX，并将原生质球转移至预冷的50 ml锥形管中。添加CHX对于冻结核糖体与mRNA的结合至关重要，从而维持核糖体依赖的mRNA与线粒体的结合。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 3,000 x g 离心球状体 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用预冷的甘露醇缓冲液洗涤两次。</li>
	<li>用4 ml冷甘露醇缓冲液重悬球状体，并转移至配备紧密研杵的15 ml容量Dounce匀浆器中。轻轻研磨15次以破碎球状体，然后将裂解液转移至13 ml离心管中。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 1,500 x g 离心 6 分钟，使裂解液中的细胞核和未破碎的细胞沉淀。</li>
	<li>小心将上清液转移至新管中。留出1 ml（25%）样品作为未分级样品（“总” 样品）。将50 ml该样品转移至新离心管中，加入15 ml 4X LSB，用于蛋白质印迹分析。 &#160;从剩余的“Total”样品中沉淀RNA（参见方案3，RNA沉淀）。</li>
	<li>在4℃下以10,000 × g离心上清液10分钟 °C 离心以沉淀线粒体。</li>
	<li>将上清液（约3 ml）转移至新离心管中，置于冰上保存。此为 细胞质中的 组分。取50 ml该样品转移至新离心管中，并加入15 ml 4x&#160;用于Western印迹分析的LSB。从剩余的“胞质”样品中沉淀RNA（参见方案3，RNA沉淀）。</li>
	<li>用3 ml甘露醇缓冲液重悬沉淀，于4 °C、10,000 x g离心10分钟。</li>
	<li>用3 ml甘露醇缓冲液重悬沉淀。该样品含有线粒体，记为 线粒体 组分。取50 ml该样品转移至新离心管中，加入15 ml 4x&#160;用于蛋白质印迹分析的 LSB</li>
</ol>
2. RNA 提取
<ol>
	<li>向每个样品中加入等体积的 8 M 盐酸胍和两倍体积的 100% 乙醇。涡旋混匀，并在 -20 °C 下孵育至少 2 小时。</li>
	<li>在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 20 分钟。弃去上清液。注意操作，因为沉淀可能不稳定。</li>
	<li>用 70% 乙醇洗涤沉淀。</li>
	<li>用 400 µl 无 RNase 水重悬沉淀，并将样品转移至新的 Eppendorf 管中。</li>
	<li>加入 0.1 倍体积的 3 M 乙酸钠（pH 5.2）和两倍体积的 100% 乙醇，再次沉淀 RNA。涡旋混匀，并在 -20 °C 下孵育至少 2 小时。</li>
	<li>在 4 °C 下以 20,000 × g 离心 20 分钟。弃去上清液，并用 70% 乙醇洗涤。</li>
	<li>将沉淀空气干燥后，用无 RNase 水重悬。将 RNA 样品于 -80 °C 保存。样品可用于 Northern 分析19 或微阵列分析18（见方案 3）。</li>
</ol>
3. 准备用于微阵列分析的RNA
<ol>
	<li>用 650 µL 无 RNase 的水重悬第 2.2 步的 mRNA。</li>
	<li>为去除任何残留的 DNA 或蛋白质，加入等体积（650 µL）酸性酚:氯仿（5:1，pH 4.7），并剧烈涡旋振荡。在最大转速下离心 2 分钟。</li>
	<li>将上层（水相）500 µL 转移至新管中。&#160;避免吸取中间相，因其含有 DNA。同时注意避免吸取酚，以免抑制逆转录反应。</li>
	<li>RNA 样品中含有大量肝素，而肝素是逆转录酶的强效抑制剂。因此，在进行 RT-PCR 或微阵列标记前需将其去除。通过 LiCl 沉淀法去除肝素：加入 LiCl 至终浓度为 2 M，并在 -20 °C 过夜孵育。</li>
	<li>在 4 °C 解冻样品，并在 4 °C 下以 20,000 × g 离心 20 分钟。</li>
	<li>小心弃去上清液，并用 80% 乙醇洗涤沉淀。按第 3.5 步所述再次离心。</li>
	<li>弃去上清液，空气干燥后用 150 µL 无 RNase 的水重悬沉淀。</li>
	<li>为去除残留的 LiCl，再次使用 0.1 体积的 3 M 乙酸钠（pH 5.3）和 3 体积的 100% 乙醇进行沉淀。在 -20 °C 孵育至少 2 小时。</li>
	<li>在 4 °C 下以最高速度离心 20 分钟。用 80% 乙醇小心洗涤透明沉淀，并进行空气干燥。</li>
	<li>用 25 µL 无 RNase 的水重悬沉淀，并将样品保存于 -80 °C。</li>
	<li>按照文献18,20中所述的 RNA 标记与杂交流程进行操作。</li>
</ol>

<ol><li>Holt, C. E., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+mRNA+localization+in+animal+cells+and+why+it+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters.</a> Science. 326, 1212-1216 (2009).</li>
<li>Donnelly, C. J., Fainzilber, M., Twiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+communication+through+RNA+transport+and+localized+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Subcellular communication through RNA transport and localized protein synthesis.</a> Traffic. 11, 1498-1505 (2010).</li>
<li>Kellems, R. E., Allison, V. F., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+type+80+S+ribosomes+associated+with+yeast+mitochondria.+II.+Evidence+for+the+association+of+cytoplasmic+ribosomes+with+the+outer+mitochondrial+membrane+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. II. Evidence for the association of cytoplasmic ribosomes with the outer mitochondrial membrane in situ.</a> J. Biol. Chem. 249, 3297-3303 (1974).</li>
<li>Kellems, R. E., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+type+80+S+ribosomes+associated+with+yeast+mitochondria.+3.+Changes+in+the+amount+of+bound+ribosomes+in+response+to+changes+in+metabolic+state%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. 3. Changes in the amount of bound ribosomes in response to changes in metabolic state.</a> J. Biol. Chem. 249, 3304-3310 (1974).</li>
<li>Suissa, M., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Import+of+proteins+into+mitochondria.+Translatable+mRNAs+for+imported+mitochondrial+proteins+are+present+in+free+as+well+as+mitochondria-bound+cytoplasmic+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Import of proteins into mitochondria. Translatable mRNAs for imported mitochondrial proteins are present in free as well as mitochondria-bound cytoplasmic polysomes.</a> J. Biol. Chem. 257, 13048-13055 (1982).</li>
<li>Fujiki, M., Verner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+cytosolic+protein+synthesis+and+mitochondrial+protein+import+in+yeast.+Evidence+for+cotranslational+import+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coupling of cytosolic protein synthesis and mitochondrial protein import in yeast. Evidence for cotranslational import in vivo.</a> J. Biol. Chem. 268, 1914-1920 (1993).</li>
<li>Yogev, O., Karniely, S., Pines, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation-coupled+translocation+of+yeast+fumarase+into+mitochondria+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Translation-coupled translocation of yeast fumarase into mitochondria in vivo.</a> J. Biol. Chem. 282, 29222-29229 (2007).</li>
<li>Eliyahu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tom20+mediates+localization+of+mRNAs+to+mitochondria+in+a+translation-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tom20 mediates localization of mRNAs to mitochondria in a translation-dependent manner.</a> Mol. Cell. Biol. 30, 284-294 (2010).</li>
<li>Garcia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-associated+yeast+mRNAs+and+the+biogenesis+of+molecular+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-associated yeast mRNAs and the biogenesis of molecular complexes.</a> Mol. Cell. Biol. 18, 362-368 (2007).</li>
<li>Marc, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNAs+targeted+to+yeast+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNAs targeted to yeast mitochondria.</a> EMBO Rep. 3, 159-164 (2002).</li>
<li>Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+mRNAs+coding+for+mitochondrial+proteins+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 17, 1551-1565 (2011).</li>
<li>Margeot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Saccharomyces+cerevisiae%2C+ATP2+mRNA+sorting+to+the+vicinity+of+mitochondria+is+essential+for+respiratory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+EMBO%22%5BJournal%5D)">In Saccharomyces cerevisiae, ATP2 mRNA sorting to the vicinity of mitochondria is essential for respiratory function.</a> J EMBO. 21, 6893-6904 (2002).</li>
<li>Saint-Georges, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mitochondrial+biogenesis%3A+a+role+for+the+PUF+RNA-binding+protein+Puf3p+in+mRNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Yeast mitochondrial biogenesis: a role for the PUF RNA-binding protein Puf3p in mRNA localization.</a> PloS one. 3, (2008).</li>
<li>Quenault, T., Lithgow, T., Traven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PUF+proteins%3A+repression%2C+activation+and+mRNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PUF proteins: repression, activation and mRNA localization.</a> Trends Cell Biol. 21, 104-112 (2011).</li>
<li>Garcia, M., Delaveau, T., Goussard, S., Jacq, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+presequence+and+open+reading+frame+mediate+asymmetric+localization+of+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial presequence and open reading frame mediate asymmetric localization of messenger RNA.</a> EMBO Rep. 11, 285-291 (2010).</li>
<li>Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+chaperone+Ssa1+affects+mRNA+localization+to+the+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria.</a> FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).</li>
<li>Ahmed, A. U., Fisher, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Import+of+nuclear-encoded+mitochondrial+proteins%3A+a+cotranslational+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Import of nuclear-encoded mitochondrial proteins: a cotranslational perspective.</a> Int. Rev. Cell Biol. 273, 49-68 (2009).</li>
<li>Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+RNA+extracted+from+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria.</a> Methods Mol. Biol. 714, 287-299 (2011).</li>
<li>Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+extensive+intra-molecular+associations+between+3%27-UTRs+and+their+ORFs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+RES%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs.</a> Nucleic Acids RES. 36, 6728-6738 (2008).</li>
<li>Melamed, D., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNA+polysomal+profiles+with+spotted+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNA polysomal profiles with spotted DNA microarrays.</a> Methods Enzymol. 431, 177-201 (2007).</li>
<li>Margeot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+are+many+mRNAs+translated+to+the+vicinity+of+mitochondria%3A+a+role+in+protein+complex+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Why are many mRNAs translated to the vicinity of mitochondria: a role in protein complex assembly.</a> Gene. 354, 64-71 (2005).</li>
<li>Mathieu, L., Marsy, S., Saint-Georges, Y., Jacq, C., Dujardin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptome+screen+in+yeast+identifies+a+novel+assembly+factor+for+the+mitochondrial+complex+III%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">A transcriptome screen in yeast identifies a novel assembly factor for the mitochondrial complex III.</a> Mitochondrion. 11, 391-396 (2011).</li>
<li>Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+gene+expression+using+two-color+RNA+labeling+in+live+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast.</a> Nat. Methods. 10, 119-121 (2013).</li>
<li>Park, H. Y., Buxbaum, A. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+mRNA+tracking+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Single mRNA tracking in live cells.</a> Methods Enzymol. 472, 387-406 (2010).</li>
<li>Thompson, M. A., Casolari, J. M., Badieirostami, M., Brown, P. O., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tracking+of+single+mRNA+particles+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+a+double-helix+point+spread+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tracking of single mRNA particles in Saccharomyces cerevisiae using a double-helix point spread function.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17864-17871 (2010).</li>
<li>Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+RNA+distribution+and+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells.</a> Nat. Methods. 6, 331-338 (2009).</li>
<li>Garcia, M., Darzacq, X., Devaux, F., Singer, R. H., Jacq, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mitochondrial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Yeast mitochondrial transcriptomics.</a> Methods Mol. Biol. 372, 505-528 (2007).</li>
<li>Reinders, J., Sickmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+yeast+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteomics of yeast mitochondria.</a> Methods Mol. Biol. 372, 543-557 (2007).</li>
<li>Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Saccharomcyes+cerevisiae+mitochondria+devoid+of+microsomal+and+cytosolic+contaminations%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations.</a> Anal. Biochem. 287, 339-342 (2000).</li>
<li>Glick, B. S., Pon, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+highly+purified+mitochondria+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Isolation of highly purified mitochondria from Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 260, 213-223 (1995).</li>
<li>Boldogh, I. R., Pon, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Cell Biol. 80, 45-64 (2007).</li>
<li>Rieder, S. E., Emr, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRieder%2C+SE+%22Isolation+of+subcellular+fractions+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.+Current+protocols+in+cell+biology+%2F+editorial+board%22">Isolation of subcellular fractions from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Current protocols in cell biology / editorial board</a>. Bonifacino, J. S. 8, (2001).</li>
<li>Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Cell Biol. 65, 37-51 (2001).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

成像技术的进步已催生出高分辨率工具，用于研究 mRNA 的定位。如今，人们能够在毫秒时间尺度上测量单个 mRNA 分子的运动。23-26然而，传统的生化方法（如上所述）同样具有信息价值，并且在某些情况下更为可取。生化分离法能够纯化大量种类的mRNA和蛋白质，因此更适合用于全基因组范围的研究。通过一次分离即可获得足量的mRNA，用于对数千个基因进行表征分析，无论是通过DNA微阵列还是RNA-seq技术。18,27同时，可以分离蛋白质并进行蛋白质组学分析，以表征线粒体上的蛋白质组28生化分级分离法可加以调整，用于将线粒体与其他细胞器（尤其是内质网）分离开来29这在某些细胞类型中可能具有优势，因为在这些细胞中，内质网与线粒体之间的高程度空间重叠会阻碍显微镜下的定位分析。生化分离方法的一个重要优点是成本较低，能够实现对大量不同样本的分析。另一个相关优势是其操作简便——如上所述的生化分离方法通常不需要对mRNA进行繁琐的荧光标记，而这一点在某些其他方法中是必需的 体内 成像研究。最后，这些传统方案的许多陷阱和伪影已被明确诊断，因此必要的对照措...

真核细胞被划分为具有特定功能的不同区室。为了实现其功能，每个区室都包含一组独特的蛋白质，这些蛋白质对其活性至关重要。这些蛋白质到达其所在区室的可能机制之一是局部翻译1,2。在此过程中，蛋白质由位于该区室内的核糖体和mRNA在其目的地直接合成。局部翻译的潜在优势包括提高蛋白质靶向效率、减少对分子伴侣的需求，以及实现位点特异性的调控机制。此外，在细胞应激导致整体翻译受到抑制的情况下，局部存在的mRNA和核糖体可作为隔离的翻译机器储备库。
近年来，线粒体已成为研究局部翻译的核心模型。 &#160;大多数线粒体蛋白由细胞核基因编码，在细胞质中翻译，随后被导入细胞器内。大量证据表明，其中许多蛋白通过局部翻译过程产生。早期电子显微镜和生化分级分离研究发现核糖体与线粒体相关联3-5这些研究随后得到了证实 体内 通过针对特定mRNAs的研究发现，这些mRNAs仅以共翻译方式被导入6,7.&#160;全基因组范围的mRNA与线粒体关联研究表明，大量mRNA定位于线粒体周围区域8-10。其中一些 mRNA 进一步通过以下方式进行了表征 在体 荧光方法，例如 FISH 或 mTAG9,11. &#160;这一关联的直接解释是，这些mRNA可作为局部翻译的模板。
这些mRNA如何与线粒体结合的机制尚不清楚。非编码区（尤其是3’ UTR）已被证明参与mRNA与线粒体的结合。12这些结构域可能作为RNA结合蛋白的结合位点，介导其转运。酵母中的研究表明，PUM蛋白家族的一个成员（Puf3）可促进mRNA与线粒体的结合8,13Puf3的一个合理作用是抑制mRNA的翻译，这基于该家族其他成员的功能，即在mRNA处于某种状态时 途中14因此，mRNA 可能以非翻译状态被运输，由与非编码区相互作用的 RNA 结合蛋白介导。或者，大量研究表明，运输过程发生在蛋白质合成的同时。特别是，已有研究显示翻译抑制剂会影响 mRNA 的结合8,13此外，翻译后的特征（如AUG、线粒体靶向序列（MTS）或开放阅读框（ORF）区域）被证明有助于定位8,11,15Hsp70家族蛋白伴侣以及线粒体外膜上的蛋白受体也被证实可支持mRNA的结合，进一步表明编码蛋白的特征对于mRNA的定位具有重要作用16这与一种模型一致，即核糖体上正在合成的蛋白质可作为识别元件，将mRNA-核糖体-蛋白质复合物靶向输送至线粒体。17.
通过多种方法研究了线粒体附近的局部翻译，包括电子显微镜技术（用于可视化核糖体）3,&#160; 荧光原位杂交9,&#160; 绿色RNA（用于检测特定mRNA）11以及生化分级分离（用于检测RNA和核糖体）10,18。尽管前者方法可检测定位 体内 并且可能实现对运输动态的可视化，而后者允许在单次实验中检测多种不同的mRNA。此外，对于生化分级分离，无需改变编码或非编码区域，因此可评估这些区域的特定功能。生化分级分离已成功应用多年，用于分离多种不同的细胞区室。其基本原理和局限性已得到充分确立，且现有方案可轻松针对不同目的进行修改。所需的仪器设备在许多实验室中均为标准配置，因此该方法通常是研究细胞内定位的首选。本文描述了一种优化后的方案，用于在核糖体与线粒体结合时分离mRNA。因此，该方案特别适用于研究线粒体附近局部翻译相关因子。

<table><tbody><tr><td>酵母提取物</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨（BactoPeptone）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>半乳糖</td><td></td><td></td><td>切勿对半乳糖进行高压灭菌</td></tr><tr><td>生长培养基</td><td></td><td></td><td>为富集线粒体，应使用任何非发酵性碳源，例如基于半乳糖的生长培养基：1% 酵母提取物、2% 蛋白胨、2% 半乳糖，经灭菌处理</td></tr><tr><td>0.1 M Tris-HCl，pH 9.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 mM Tris-HCl，pH 7.6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM DTT 缓冲液</td><td></td><td></td><td>0.1 M TrisHCl pH 9.4，10 mM 二硫苏糖醇（DTT），每次现配现用</td></tr><tr><td>1.2 M 山梨醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16 mM K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;#956;m 滤膜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>溶壁酶缓冲液（Zymolyase Buffer）</td><td></td><td></td><td>1.2 M 山梨醇，4 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，16 mM K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;。将此缓冲液过滤（0.2 &amp;#956;m），室温保存以备后续使用</td></tr><tr><td>溶壁酶 20T（Zymolyase 20T）</td><td></td><td></td><td>20,000 U/g</td></tr><tr><td>恢复培养基（Recovery medium）</td><td></td><td></td><td>在基于半乳糖的生长培养基中添加 1 M 山梨醇</td></tr><tr><td>0.1 mg/ml 环己酰亚胺（CHX）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.6 M 甘露醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mM MgAc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 mg/ml 肝素</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>甘露醇缓冲液</td><td></td><td></td><td>0.6 M 甘露醇，30 mM Tris-HCl pH 7.6，5 mM MgAc，100 mM KCl。新鲜加入：0.5 mg/ml 肝素，0.1 mg/ml CHX 和 1 mM PMSF。将此缓冲液过滤后冰上使用</td></tr><tr><td>8 M 盐酸胍</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% 和 70% 乙醇（EtOH）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 M 醋酸钠，pH 5.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 M LiCl 储存液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mM Tris HCl pH 6.8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-巯基乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x LSB</td><td></td><td></td><td>250 mM Tris HCl pH 6.8，8% SDS，40% 甘油，20% &amp;#946;-巯基乙醇，0.02% 溴酚蓝</td></tr><tr><td>容量为 15 ml 并配有紧密研杵的Dounce匀浆器</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

分离与酵母线粒体相关的mrnas以研究局部翻译机制

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

大多数线粒体蛋白由细胞核基因组编码，需要被导入细胞器内。这种导入过程可能在蛋白质于线粒体附近合成时即发生。这一可能性得到了近期研究的支持，这些研究表明，许多编码线粒体蛋白的mRNA定位于线粒体周围区域。结合早期关于核糖体与线粒体外膜相关联的发现，这些结果提示存在一种局部化的翻译过程。这种局部翻译可能提高蛋白导入效率，提供独特的调控位点，并减少异位表达的情况。已有多种方法被用于鉴定介导局部翻译的因子和元件。其中标准方法是差速离心法进行亚细胞组分分离。该方案的优点在于可在一次操作中同时分离mRNA、核糖体和蛋白质，随后可通过各种分子生物学和生物化学方法对其进行表征。此外，还可对分离得到的材料进行转录组学和蛋白质组学分析，从而获得全基因组水平的深入见解。利用酵母作为此类研究的模式生物具有快速、成本低和操作简便的优势。此外，先进的遗传工具以及可获得的基因敲除菌株有助于对候选因子进行验证。

本方案可实现含线粒体组分与细胞质组分的分离。检验分离效果的最佳方法是对不同分离步骤所得样品进行Northern分析和Western分析（图1），并据此评估三个关键的质量参数。首先，需判断样品中的RNA或蛋白质是否保持完整——在分析结果中应呈现为清晰的条带；若发生降解，则会出现额外的较短条带或弥散信号。其次，通过将各步骤的信号强度与上样输入（即 总样品）进行比较，可获得制备过程中组分损失的重要信息；若总样品与相对信号量之间存在显著差异，则表明存在严重损失。最后，也是最重要的，是评估线粒体组分与细胞质组分之间的分离质量。完整线粒体的有效分离应表现为：线粒体转录的RNA仅在线粒体组分中检测到信号，而在细胞质组分中无信号（图1A）；此外，线粒体相关蛋白在Western blot中仅出现在线粒体组分中，而细胞质蛋白则仅存在于细胞质组分中（图1B）。
图1展示了本实验方案中另外两个典型结果：首先，核基因编码的mRNA与线粒体的结合情况因基因而...

许多编码线粒体蛋白的mRNA与线粒体外膜相关联。本文描述了一种旨在分离酵母线粒体及其相关mRNA和核糖体的亚细胞分级分离方法。该方案可应用于在不同条件下培养的细胞。

关键词：线粒体，mRNA，核糖体，亚细胞分级分离，酵母&#160;为了揭示线粒体附近 mRNA 定位及局部翻译的机制。

分离与酵母线粒体相关的mRNAs以研究局部翻译机制

大多数线粒体蛋白由细胞核基因组编码，需要被导入细胞器内。这种导入过程可能在蛋白质合成过程中即开始……

本实验的总体目标是分离与正在翻译的 mRNA 相关的线粒体。首先，在促进线粒体富集的条件下培养酵母细胞并收集细胞；第二步是在环己酰亚胺存在下轻柔地裂解细胞。接下来通过差速离心将线粒体与可溶性组分分离。最后一步是从线粒体和对照样品中提取RNA。最终通过Northern分析来检测线粒体相关RNA的纯度和质量。该技术的主要优势在于，可在一次制备过程中分离出多种类型的 RNA，从而能够进行比较分析。该方法有助于回答细胞生物学中的关键问题，例如细胞内定位和细胞器功能。在此步骤中，将从 100 至 150 毫升酵母细胞中纯化线粒体，这些细胞在 30 摄氏度下于非发酵性培养基中培养至 OD 600 为 1 至 1.5。在室温下以 3000 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，并用双蒸水重悬沉淀后再次离心。弃去上清液后，称量细胞沉淀。通常从 100 毫升细胞中可获得约 0.6 克。每 0.5 克细胞用 1 毫升 DTT 缓冲液重悬沉淀。使用还原剂处理细胞非常重要，以破坏细胞壁内的二硫键，从而提高水解效率。将细胞在30摄氏度下轻轻振荡孵育10分钟。随后在室温下以3000 × g离心5分钟。弃去上清液，并将沉淀重新悬浮。每0.15克细胞加入1毫升xmal liase缓冲液，切勿涡旋。取10微升细胞样品加入990微升水中，测定OD 600并记录该数值。向细胞中加入 freshly prepared xmal liase，以水解葡萄糖聚合物在β-1,3-葡聚糖连接位点的结构，并生成Sphero plast。此后，Sphero plast 应始终保存在等渗溶液中，以避免细胞裂解；将细胞在 30 摄氏度下轻轻振荡孵育 15 分钟。为验证细胞壁的水解及 Sphero plast 的形成，取 10 微升细胞与 990 微升水混合，测定 OD 600。由于渗透压差异，Sphero plast 应发生裂解，OD 600 值应比加入木聚糖酶前至少降低十倍。若未达到该标准，则继续加入木聚糖酶孵育 15 分钟。用 100 毫升恢复培养基重悬 Plast 的 PHE，并将 Plast 球体转移至 Helen Meyer 烧瓶中。在 30 摄氏度下振荡孵育 1 小时。此恢复步骤是必要的，因为在 XYs 处理期间翻译过程被抑制，且 mRNA 定位受到破坏。一小时后，加入 0.1 毫克/毫升的环己酰亚胺，并将 Sphero plast 转移至预冷的 50 毫升离心管中。加入环己酰亚胺对于冻结核糖体与 mRNA 的结合至关重要，从而维持核糖体依赖性的 mRNA 与线粒体的结合状态。在4°C条件下，以3000 × g离心五分钟后弃去上清液，并用冷甘露醇洗涤两次。缓冲液可重复使用。用4毫升冰冷的甘露醇缓冲液重悬plass球体，并将悬浮液转移至一个容量为15毫升、配有紧密适配研杵的下压式匀浆器中。轻轻研磨15次以破碎plass球体，然后将裂解液转移至13毫升离心管中。在4°C条件下，以1,500 × g离心6分钟。离心收集细胞核和未破碎的细胞。小心将上清液转移至新离心管中。保留一毫升或25%的样品作为未分级或总样品。取 50 微升该样品转移至新管中，并加入 15 微升 4×LSB。对于蛋白质印迹分析，其余总样品将用于沉淀 RNA，以进行 Northern 印迹和基因芯片分析。在 10,000 ×g 条件下离心上清液。在 4°C 条件下离心 10 分钟。为沉淀线粒体，将上清液转移至新离心管中并置于冰上。此为细胞质组分。取 50 微升该样品转移至新试管中，并加入 15 微升 4× XLSB。用于 Western 印迹分析；剩余的细胞质样品中的 RNA 将被沉淀，用于 Northern 印迹和微阵列分析。用 3 毫升甘露醇缓冲液洗涤沉淀，并在 10,000 × g 条件下再次离心。在 4 摄氏度下离心 10 分钟。用 3 毫升甘露醇缓冲液重悬沉淀物。此样品含有线粒体，称为线粒体组分。取50微升该样品转移至新管中，加入15微升4×上样缓冲液（XLSB），用于蛋白质印迹分析。开始此操作时，向每个样品中加入等体积的8摩尔胍二乙基（guanidium）、HCEL以及两倍体积的100%乙醇，涡旋混匀后于-20摄氏度孵育至少2小时。随后在4摄氏度下以10,000×g离心20分钟。弃去上清液。由于沉淀物可能不稳定，操作时需小心。用 70% 乙醇洗涤沉淀后，将沉淀重悬于 400 µL 无 RNase 的水中，并将样品转移至新的离心管中。通过加入0.1倍体积的3摩尔醋酸钠（pH 5.2）和两倍体积的100%乙醇沉淀RNA，涡旋混匀后在-20摄氏度下孵育至少两小时。在4摄氏度下以20,000 ×g离心样品20分钟。弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀。将沉淀在空气中干燥，然后用无RNase的水重悬RNA。将样品在-80摄氏度保存。随后可将样品用于Northern印迹或微阵列分析。为进行微阵列分析，首先将从盐酸胍和乙醇沉淀中获得的每份mRNA沉淀用650 µL无RNase的水重悬，并转移至带螺帽的离心管中。然后加入650 µL酸性酚-氯仿，充分涡旋混匀后，在最大转速下离心2分钟。将上层水相的500微升转移至新离心管中。避免吸取中间层，因其含有DNA。同时注意避免吸取苯酚，因为苯酚可能抑制逆转录反应。通过氯化锂沉淀法从RNA样品中去除肝素。加入氯化锂至终浓度为2摩尔，在-20摄氏度下孵育样品过夜。次日将样品在4摄氏度下解冻，并以20,000 ×g离心。在 4 摄氏度下离心 20 分钟。小心弃去上清液，用 80% 乙醇洗涤沉淀，再次离心。再次弃去上清液，空气干燥，将沉淀重悬于 150 µL 无 RNase 的水中，以去除任何残留的氯化锂沉淀，再加入 0.1 倍体积的 3 M 醋酸钠（pH 5.3）和 3 倍体积的 100% 乙醇，于 -20 摄氏度孵育至少 2 小时。在4°C条件下以最高速离心20分钟。用80%乙醇小心洗涤透明沉淀，并风干。最后用25 µL无RNase的水重悬沉淀，并将样品置于-80°C保存。通过在不同分离步骤的样品上进行Northern分析和Western分析，是检验本方案能否成功将含线粒体的组分与胞质组分分离的最佳方法。本示例中的样品来自分馏前（即总组分）、胞质组分以及线粒体组分。对以下mRNA进行了Northern分析：COB和一种RNA。这些是在线粒体内转录的，包括 CO1 和编码一种被导入线粒体的蛋白质的 mRNA；CT1 和编码细胞质肌动蛋白的 mRNA；以及 SEC61 和编码内质网驻留蛋白的 mRNA。底部面板为 Northern 印迹膜的亚甲蓝染色结果，可见两条明显的 RNA 条带，分别为 25S 和 18S。由于COB在线粒体内转录，其信号应仅存在于线粒体中，本研究中观察到的结果正是如此。若在胞质组分中出现COB，则表明在线粒体分离过程中发生了线粒体裂解。ACO1 编码一种被导入线粒体的蛋白质，主要存在于线粒体组分中。CT1 编码一种细胞质蛋白，因此主要存在于细胞质组分中。线粒体组分中存在 SEC61 表明该组分中含有内质网成分。RNAs 的信号在两个组分中均出现，表明存在核糖体。对以下蛋白质进行了蛋白质印迹分析：线粒体外膜蛋白 POR1、HxK1A、细胞质蛋白 CUE1、内质网蛋白 RPL39 以及核糖体蛋白。正如预期，POR1 信号仅在线粒体组分中被检测到。如果在细胞质组分中检测到 POR 信号，则表明在线粒体组分制备过程中发生了线粒体组分的解离。此外，如预期一致，hx K one 仅在细胞质组分中被检测到。线粒体组分中强烈的 CUE one 信号表明，大量与内质网相关的物质在分离线粒体组分时被共同分离出来。这可能是内质网与线粒体之间已知的物理接触的结果。RPL39 信号在两个组分中均有出现，再次证实了核糖体存在于这两个组分中；若省略回收步骤，会导致线粒体组分（M 组分）中的核糖体消失，从而影响 mRNA 与线粒体的结合。除了验证线粒体组分与胞质组分分离的质量外，还需确认样品中的 RNA 或蛋白质是否保持完整，并确保在样品制备过程中未发生严重的 RNA 或蛋白质损失。在分析中，完整的RNA和蛋白质应显示为不同的条带，如图所示。对于编码一种被导入线粒体的蛋白质的c CCP mRNA而言，若出现额外的较短条带或弥散条带，则表明其已发生降解。严重的降解将导致总信号量与相对信号量之间存在显著差异，但综合来看，本实验中并未观察到此种情况。这些结果验证了该方案作为一种在单次操作中分离 mRNA、核糖体和蛋白质的有效方法。通过此操作流程，可进一步开展转录组测序（RNA-Seq）或蛋白质组学分析等全基因组范围的研究，以鉴定细胞器功能的关键特征与独特属性。观看本视频后，您应能充分掌握如何分离与线粒体相关的 RNA。

分离与酵母线粒体相关的mRNAs以研究局部翻译机制

探索更多视频