מדידת pH בו זמנית בendocytic ותאי Cytosolic בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה confocal

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא למדוד בו זמנית pH שלפוחית וציטוזולי בתאים חיים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. זה מושג על ידי דגירה ראשונה של התאים עם בדיקות חישת ה-pH, HPTS ו-SNF F1, המסמנות את התאים האנדוזומיים והליזוזומליים ואת הציטוזול בהתאמה. לאחר מכן, התאים ממוקמים בתא מבוקר סביבתי תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, והתוכנה מוגדרת למדוד את הקרינה של הבדיקות בתא.

התאים מודגרים בתמיסות מכוילות pH שונות. עקומת pH סטנדרטית נבנית באמצעות רגרסיה לא ליניארית. משוואות מעריכיות נקבעות עבור שני הבדיקות ומשמשות לאחר מכן להמרת עוצמות הקרינה של דגימות לערכי pH.

שיטה זו מאפשרת קביעת pH שלפוחית וציטוזולי מדגימות לאחר טיפולים שונים ויכולה לאפשר חקר ויסות ה-pH התוך תאי במהלך תהליכים ביולוגיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות למדידת pH תוך תאית הוא שהשיטה שלנו מאפשרת מדידה של דינמיקת pH תוך תאית בתאים חיים תוך ביטול חפצים ורעשי רקע במהלך ההדמיה, מדגים את ההליך יהיה פס לוסייר, הדוקטורנט שפיתח שיטה זו לכיול pH תאי. יש צורך ליצור סדרה של חמש תמיסות של 50 מיליליטר מ- pH 5.5 עד 7.5 במרווחים של 0.5.

הוסף אשלגן הידרוקסיד רגיל אחד או חומצה הידרוכלורית טיפתית כדי להגדיר את ערכי ה-pH. לאחר מכן לכל תמיסה מכוילת pH הוסף 0.05 מיליליטר של גרסין IOR. ב-10 מילי-מולרית לריכוז סופי של 10 מיקרו-מולארי, ריסין יגדיל את חדירות קרום התא בנוכחות ריכוזים דה-פולריזציה של אשלגן חוץ-תאי מתחת למכסה המנוע, תאי זרעים בכלי תרבית של 35 מילימטר עם שני מיליליטר של מדיום המכיל 10% סרום בקר עוברי ואנטיביוטיקה במטרה להשיג מפגש של 50% ב-24 שעות דגירה ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר זריעת כל הלוחות הנדרשים לניסוי, זרעו חמש צלחות נוספות לכיול. דגרו על צלחות אלה למשך 24 שעות, 24 שעות לאחר מכן ו -16 שעות לפני ההדמיה. הוסף שני מיקרוליטרים של תווית האברון HPTS על טוחנת אחת לריכוז סופי של HPTS מילי-מולרי בתמיסה למחרת בבוקר, כשלוש שעות.

לפני ההדמיה. הסר את ה-HPTS על ידי ביצוע שתי שטיפות עם PBS. לאחר מכן הוסיפו שני מיליליטר של מדיום נטול סרום ואפשרו לתאים לדגור לפחות שעתיים נוספות.

רגע לפני ההדמיה דגרו על התאים עם חמישה SNF מיקרומולרי, אחד על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של SNF מילי-מולרי אחד, אחד לאחר תקופת הדגירה של SNF. שטפו את התאים פעמיים עם PBS והוסיפו שני מיליליטר של מדיום נטול סרום, ואז המשיכו בהדמיה. התאים.

הדמיה של התאים צריכה להתבצע באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק הפוך ספקטרלי, המצויד בבמה ממונעת ובתא סביבתי. בעת שימוש בצלחות פטרי מפלסטיק, מטרה של פי 40 היא המתאימה ביותר. יש להתאים את התוכנה לשתי ערכות ערוצים וירטואליים בתוכנה, להתאים את אורך גל העירור ואורכי גל הפליטה.

עבור HPTS ו-SNF one, הצמצם הקונפוקלי מוגדר ל-175 מיקרון כברירת מחדל, ויש להגדיר את הצמצם האופטימלי באופן ידני ל-300 מיקרון. לאחר שהתא התחמם ל-37 מעלות צלזיוס, התחל את הכיול, שטוף צלחת תאים פעמיים נוספות באמצעות PBS, ולאחר מכן החלף את המדיום בתמיסת הכיול הראשונה. כעת הכנס את התאים לתא וכיול את שני הצבעים הרגישים ל-pH רוכשים עד 30 תמונות זמן-lapse במרווחי זמן של דקה אחת.

ניתן לאסוף כל ערימת תמונות בעובי של 0.4 מיקרון ו-800 פיקסלים מרובעים. ובין התמונות, יש לתכנת את התריס כך שיישאר סגור. שימו לב לעוצמת הפלואורסצנט בכל דקה, שבדרך כלל תתייצב בסביבות 20 דקות.

לאחר שהפלואורסצנט מתייצב, צלם תמונות מארבעה או חמישה שדות המכילים 15 עד 20 תאים, ושני הבדיקות. תמונות אלה משמשות לחישובי העקומה. חזור על תהליך זה עבור כל פתרון כיול.

לאחר מכן המשך בהדמיה של לוחות תנאי הניסוי שעבורם אין צורך בשטיפות בניתוח כל תמונה, ראשית, הפחיתו דיגיטלית את הקרינה החוץ-תאית של הרקע. לאחר מכן בחר שלפוחיות וציטוזול מסומנים מתמונות מאוחסנות באמצעות מסכה בינארית. עבור כל בדיקה לחישת pH, עוצמות הקרינה נמדדות בסולם מאפס עד 4,095.

חשב את העוצמה הממוצעת עבור כל הפיקסלים באברון או בציטופלזמה. באמצעות ערכים אלה, חשב יחסי פלואורסצנטיות עבור HPTS ועבור snf. אחד עבור עקומות כיול מתווה את יחסי הקרינה המתקבלים עבור כל פתרון כיול כפונקציה של התאמת עקומת כיול pH צריכה להיעשות באמצעות משוואה מעריכית.

לבסוף, השתמש בעקומות הכיול כדי להפוך את היחסים לערכי pH ובכך להשיג ערכי pH ציטוזוליים ואברונים בתאים חיים בתנאי ניסוי. הושגו ראיות ברורות לכך ש-HPTS מסמן תאים אנדוזומיים וליזוזומליים על ידי צביעה עם אלקסה 5 46 טרנספרין מצומד לצביעה של אנדוזומים או עם בדיקה אטרופית פלואורסצנטית. גשש ליו.

תמונות אדומות עמוקות נאספו עבור כל בדיקה כמתואר בתאי HT 10 80. נבדקו חמישה פתרונות כיול יציבות גישה פלואורסצנטית לאחר 15 דקות בתמיסות כגון עם תמיסות pH 6 ו-pH 7.5 בעקומת הכיול עבור pH נתון, הנתונים מייצגים את היחס בין עוצמות הקרינה ב-558 עד 405 ננומטר עבור HPTS או 644 עד 584 ננומטר עבור SNF אחד. שתי העקומות צוידו במשוואה מעריכית.

יעילות השיטה ב-HT 10 80 חי הוערכה באמצעות אמוניום כלוריד, בסיס חלש המגביר את ה-pH התוך תאי. הבסיס העלה את ה-pH של הציטוזול וגם של השלפוחית. השיטה הוערכה גם באמצעות B mycin, A one, מעכב של va a TPAs bamy, A אחד גרם לאלקליניזציה של תאים אנדוזומיים וליזוזומליים, אך לא שינה את ה-pH הציטוזולי.

לבסוף, נבדק EIPA, מעכב של NHE one. הוא החמיץ את הציטוזול עד ל-pH של 6.62, אך לא השפיע על ה-pH. עד כאן.

חקר הומאוסטזיס pH תאי הוגבל הן על ידי שינויי pH מהירים המתרחשים בתוך התאים, כמו גם מחסור בכלים לחקר pH בתוך תאים. אנו מתארים היום גישה פשוטה צעד אחר צעד למדידה בו זמנית של pH ציטוזולי ואנדוזומי בתאים חיים בודדים. זה חשוב במיוחד לחקר הומאוסטזיס pH תאי בתאים שבהם מוטציות או תרופות יכולות להשפיע על הזרם והזרם של פרוטונים בתוך התא האנדוזומי.