Cryo-microscopia elettronica Preparazione del campione per mezzo di un Focused Ion Beam

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare un campione per la microscopia elettronica criogenica (cryo TEM) estraendo una lamella con fascio ionico focalizzato da un campione voluminoso congelato criogenicamente. Questo viene realizzato immergendo innanzitutto il campione in azoto liquido per congelarlo rapidamente e montandolo all'interno del microscopio elettronico a scansione con fascio ionico criogenico (cryo FIB-SEM). Il secondo passaggio consiste nel ritagliare una sottile lamella mediante il fascio ionico e trasferirla su una griglia per TEM utilizzando un nano-manipolatore refrigerato.

Successivamente, la griglia TEM viene trasferita dal supporto SEM al supporto TEM in una stazione di trasferimento. L'ultimo passaggio consiste nel trasferire il supporto TEM nel microscopio elettronico a trasmissione criogenico (cryo TEM) per ulteriori analisi. Infine, il cryo TEM viene utilizzato per ottenere immagini ad alta risoluzione, tomogrammi o mappe a raggi X della lamella estratta.

Questa tecnica ci permetterà di analizzare la materia morbida con risoluzione massima nel microscopio elettronico a trasmissione, selezionando preventivamente il punto di analisi mediante altre microscopie, come la microscopia ottica o la microscopia elettronica a scansione. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la criomicrotomia Mac, è che si evitano artefatti di preparazione come la compressione e la deformazione del campione. Montare innanzitutto due griglie TEM per campioni a fascio ionico focalizzato.

Sul portacampioni per microscopio elettronico a scansione (SEM), fissare le griglie serrando le viti corrispondenti con un cacciavite e chiudere gli otturatori; montare un supporto campione adatto al campione e aggiungere una porzione del campione. Ad esempio, utilizzare una pipetta per depositare gocce su un supporto piatto. Quindi montare il portacampioni SEM sul dispositivo di trasferimento sotto vuoto (VTD).

Dopo aver aggiunto azoto liquido nella stazione per la formazione della poltiglia e aver effettuato la pompa a vuoto, aprire la stazione ed immergere rapidamente il portacampioni per SEM per congelarlo, quindi ripetere la pompa a vuoto fino al termine dell'ebollizione e alla ricomparsa della poltiglia. Successivamente, ritrarre il portacampioni per SEM nella camera a vuoto del VTD e sigillarlo. Compensare la pressione nella stazione per la formazione della poltiglia e nella camera di preparazione criogenica; aprire il portello esterno dell'airlock.

Quindi allineare la guarnizione del VTD con lo sportello della camera di preparazione criogenica e avviare la pompa. Quando si raggiunge un buon livello di vuoto, azionare la spina dello sportello per aprire la guarnizione del VTD e lo sportello esterno. Inserire quindi il supporto di trasferimento per SEM.

In seguito, utilizzare un coltello freddo per aprire i coperchi protettivi degli alloggiamenti della griglia TEM. Spegnere la tensione elevata sul microscopio elettronico a scansione con fascio ionico focalizzato e aprire la serratura interna. Quindi utilizzare il VTD per trasferire il portacampioni SEM nella camera del campione.

Una volta inserito il portacampioni del microscopio elettronico a scansione (SEM) nello stadio freddo, disinserire il sistema di deposizione da vapore (VTD) spingendo e ruotando. Ritirare completamente la barra del VTD all'interno della camera a vuoto del VTD e chiudere l'airlock interno, l'airlock esterno e la guarnizione del VTD. A questo punto, riscaldare il gas precursori a 24-26 gradi Celsius e posizionare il sistema di iniezione del gas o l'ago del sistema di iniezione del gas (GIS) a un'altezza di circa un millimetro sopra la superficie del campione.

Durante l'acquisizione dell'immagine con il fascio di elettroni, aprire la valvola del gas per alcuni secondi. Successivamente, polimerizzare il deposito sulla regione di interesse, o ROI, utilizzando un fascio di ioni da 1000 picoampere a basso ingrandimento. Dopo la polimerizzazione, inclinare il campione a 52 gradi in modo che la superficie risulti perpendicolare al fascio di ioni.

Procedere con la fresatura. Due trincee di fissaggio. Su entrambi i lati della zona di interesse (ROI), riportare il campione a zero gradi ed utilizzare il fascio ionico per rimuovere i lati e l'intera parte inferiore della lamella, assicurandosi che i segni di taglio attraversino completamente tutta la lamella.

Dopo aver inserito l'ago GIS, manovrare il nano manipolatore finché la sua punta non entra in contatto fisico con la lamella, preferibilmente sul lato. Aprire la valvola GIS per alcuni secondi e monitorare il deposito criogenico mediante imaging continuo con il fascio di elettroni. Quando è stato depositato criogenicamente un ulteriore strato di platino spesso da uno a due micrometri, chiudere la valvola; successivamente, indurire il platino solo nei pochi micrometri intorno al punto in cui il nano manipolatore è a contatto con la lamella.

Quindi utilizzare una corrente elevata del fascio ionico per staccare liberamente la lamella. Manovrare con attenzione il manipolatore nanometrico per estrarre la lamella dalle trincee e spostarla ad almeno 500 micrometri sopra la superficie del campione. Dopo aver ritratto l'ago, abbassare di alcuni millimetri la piattaforma del campione e spostarla finché una delle griglie TEM non è visibile.

Spostare l'area di attacco sulla griglia in posizione di lavoro e inserire l'ago GIS. Successivamente, manovrare con attenzione il nano manipolatore per portare la lamella attaccata a contatto fisico con l'area di attacco sulla griglia del TEM, aprire la valvola del gas per alcuni secondi e depositare criogenicamente uno strato aggiuntivo di platino spesso da uno a due micrometri, indurendo il platino soltanto in un raggio di pochi micrometri attorno al punto di contatto tra la lamella e la griglia del TEM. Quindi utilizzare un fascio ionico ad alta corrente per staccare la lamella dal nano manipolatore.

Inclinare il campione a 52 gradi e utilizzare il fascio ionico per ridurlo a trasparenza elettronica. Dopo aver purgato la stazione di trasferimento criogenica con gas azoto secco, inserire il portacampioni TEM criogenico nella fessura appropriata della stazione di trasferimento criogenica e riempire con azoto liquido. Successivamente, immergere un cacciavite, lo strumento di fissaggio del campione per TEM e una pinzetta in un contenitore criogenico riempito con azoto liquido, al fine di raffreddarne le punte alla temperatura desiderata.

Dopo aver abbinato il VTD al portello esterno, portare la fase fredda all'altezza di trasferimento di 16 millimetri. Dopo aver spento l'alta tensione, aprire il sigillo del VTD, il portello esterno e il portello interno. Quindi utilizzare la barra del VTD per bloccarla nel supporto di trasferimento del SEM spingendo e ruotando in senso orario.

A questo punto, ritirare il supporto di trasferimento del SEM nella camera criogenica di preparazione. Utilizzare il coltello freddo per chiudere i coperchi protettivi delle griglie per TEM. Quindi utilizzare l'asta VTD per spostare il campione nella camera a vuoto del VTD, chiudere e sigillare l'airlock.

Quindi sfiatare il compartimento esterno e staccare il VTD. Collegare il VTD alla porta SEM della stazione di trasferimento criogenica. Mentre si effettua il flushing con azoto secco, utilizzare il perno presente sulla stazione per aprire il sigillo del VTD e inserire il supporto di trasferimento SEM nell'apertura della stazione di trasferimento criogenica.

Utilizzando il cacciavite freddo, aprire uno dei coperchi e allentare la vite corrispondente, mantenendo la griglia per microscopia elettronica a trasmissione (TEM) in posizione. Successivamente, prendere la griglia TEM e posizionarla nel portagriglia TEM utilizzando le pinzette fredde. Dopodiché, fissare saldamente la griglia TEM al portagriglia.

Utilizzando l'anello esagonale refrigerato, chiudere lo scatto del portacampioni criogenico per microscopio elettronico a trasmissione e scollegare la stazione di trasferimento criogenico dal sistema di pompaggio. Trasportare la stazione e il controllore del riscaldatore del portacampioni vicino al microscopio elettronico a trasmissione e ricollegarli. Impostare lo stadio del campione del microscopio elettronico a trasmissione su un'inclinazione di meno 70 gradi.

Successivamente, impostare il tempo di pompaggio più breve per l'airlock con un solo ciclo di spurgo con gas azoto secco. Rimuovere il portacampioni TEM dalla stazione di trasferimento criogenica e inserirlo nel primo stadio del goniometro inclinato, il che avvierà il ciclo di pompaggio. Al termine del ciclo, impostare il goniometro in modo che torni a zero gradi, tenendo saldamente il portacampioni TEM in modo che non ruoti insieme al goniometro.

Quindi inserire il portapreparati attraverso il goniometro completamente all'interno del TEM. Infine, ricaricare il contenitore del portapreparati criogenico per TEM con azoto liquido. In questo metodo, le spore di Aspergillus niger vengono prima analizzate mediante SEM per identificare il sito di estrazione.

Una sezione trasversale di qualsiasi spora è sufficiente, ma è possibile posizionare la regione di interesse (ROI) per l'estrazione con una precisione submicrometrica, in modo da sezionare una cellula specifica a una distanza precisa dalla membrana cellulare. Una volta identificata la caratteristica di interesse, si procede con il primo passaggio del criodeposizione. Per proteggere il campione dai danni del fascio durante la mola ionica, il campione viene inclinato a 52 gradi, seguito dalla sputterizzazione di due trincee su entrambi i lati della mella. Il campione viene quindi riportato in posizione verticale e ulteriormente lavorato, lasciando soltanto due piccoli ponticelli che lo collegano alla massa principale.

Il nano manipolatore raffreddato viene portato a contatto con la lamella e un ulteriore deposito criogenico di platino li salda insieme. I piccoli ponticelli di collegamento vengono asportati mediante fresatura, e il nano manipolatore sposta la lamella vicino all'area di attacco di grado TEM, dove viene saldata mediante un deposito finale di platino criogenico. Il nano manipolatore viene quindi separato dalla lamella, che viene assottigliata fino a raggiungere la trasparenza agli elettroni.

Con il fascio ionico, la lamella viene trasferita al microscopio elettronico a trasmissione (TEM), dove possono essere impiegati tecniche di spettroscopia ad alta risoluzione, tomografia e altre metodologie. Questo metodo contribuirà a comprendere le interfacce tra tessuti molli cardiaci in sistemi come sonde neurologiche o impianti ossei. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare campioni di TM crio che siano privi di artefatti e che possano essere estratti da una regione specifica di un campione biologico con precisione submicrometrica.