Konstruktion und Charakterisierung eines neuartigen Bioreaktor Stimmlippen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Wirkung der Vibrationsstimulation auf mesenchymale Stammzellen mit Hilfe eines Bioreaktors zu untersuchen, der die Phonation emulieren soll. Dies wird durch die Herstellung von Poly-Epsilon-Capralacton-Gerüsten erreicht, um ein dreidimensionales Substrat für Zellkulturen bereitzustellen, das dem Stimmband ähnelt. In einem zweiten Schritt werden die Gerüste in Silikonmembranen eingearbeitet, die die Übertragung der Schwingung auf die Zellkonstrukte erleichtern.

Als nächstes wird die Laser-Doppler-Vibration verwendet, um die Schwingungseigenschaften jeder Membrangerüstkombination zu bestimmen. Letztendlich können EISA- und quantitative R-T-P-C-R-Analysen durchgeführt werden, um die zellulären Reaktionen auf Protein- und Translationsebene zu bewerten. Diese Methode kann zentrale Fragen der Laryngologie beantworten, wie z.B. die Reifung der Stimmlippe und die Folgen von Stimmmissbrauch

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Behandlung von Stimmlippenerkrankungen aufgrund des Niveaus der zellulären Kontrolle, das jetzt mit dieser Methode zur Herstellung des Gerüsts möglich ist, lösen Sie zuerst PCL-Pellets in Chloroform in einer Konzentration von 15 Gewichtsprozent auf. Laden Sie dann die resultierende Lösung in eine 10-Milliliter-Spritze, die mit einer 21-Gauge-Nadel mit stumpfem Ende verschlossen ist. Verriegeln Sie die Spritze mit einer programmierbaren Spritzenpumpe und stellen Sie die Durchflussmenge auf einen Milliliter pro Stunde ein.

Platzieren Sie dann einen mit Aluminiumfolie bedeckten Auffangbehälter quer von der Nadel waagerecht mit einer Nadelspitze zum Auffangabstand von etwa 18 Zentimetern. Klemmen Sie als Nächstes eine positive Krokodilklemme in die Mitte der Nadel und schleifen Sie die Klammer an den Kollektor. Stellen Sie die Spannung am Hochspannungsnetzteil auf 15 Kilovolt ein und achten Sie darauf, dass Sie sich von der Nadel fernhalten.

Schalten Sie dann die Spritzenpumpe und das Netzteil ein. Verwenden Sie ein trockenes Papiertuch, um die restliche Polymerlösung, die die Nadelspitze umgibt, schnell zu entfernen, bevor die stabilen Faserstrahl- und Tailor-Cone-Formen die Fasern etwa sieben Stunden lang auf dem Aluminiumkollektor auf einer Dicke von 250 bis 300 Mikrometern ansammeln können, und lagern Sie das Ergebnis dann ein bis zwei Tage lang in Gerüsten in einem Vakuumtrocknen, um Lösungsmittelreste zu entfernen. Die PCL-Gerüste enthalten mikrometergroße interstitielle Poren und zufällig verwickelte Fasern mit einem durchschnittlichen Durchmesser von etwa 4,7 Mikrometern.

Bei einer höheren Vergrößerung werden nanoskalige Rillen und Poren auf den einzelnen Fasern sichtbar, um den Bioreaktor zusammenzusetzen. Beginnen Sie damit, mit einem Biopsiestanzen mit einem Durchmesser von 12 Millimetern den Außendurchmesser einer acht Millimeter großen kreisförmigen Scheibe aus einer kürzlich gesponnenen PCL-Matte zu schneiden. Verwenden Sie dann einen zweiten Acht-Millimeter-Biopsiestempel, um zu ritzen, wo die Arme geschnitten werden sollen.

Schneiden Sie nach dem Einritzen mit einer Skalpellklinge die Kanten der Arme nach außen und führen Sie das Gerüst über die ausgestreckten Arme in die Nut der Silikonmembran ein. Glätten Sie das eingesetzte Gerüst, indem Sie mit einer Flachkopfpinzette vorsichtig auf die Oberfläche drücken, und befestigen Sie dann ein acht mal zwei Millimeter großes Stück dünne Aluminiumfolie an dem PCL-Gerüst. Um die Laserreflexion zu unterstützen, befestigen Sie das montierte PCL-Gerüst aus Silikonmembran in der Vibrationskammer.

Schieben Sie dann die Silikonmembran zwischen gepaarte Acrylblöcke ein. Sichern Sie die Montage mit vier Eckschrauben mit einem Mikrodrehmomentschraubendreher, der auf eine konstante Kraft von 35 Cent pro Newtonmeter eingestellt ist, wodurch eine wasserdichte, 24 Millimeter breite und 18 Millimeter tiefe Vibrationskammer entsteht. Als nächstes wurde ein drei Fuß langer Mini-Werber mit erweiterter Reichweite unter der Vibrationskammer durch einen weiteren Satz Eckschrauben am unteren Acrylblock montiert, wodurch die Montage eines einzelnen Vibrationsmoduls abgeschlossen wurde.

Nachdem Sie sieben zusätzliche Vibrationsmodule repliziert haben, befestigen Sie vier der Module an einer von zwei stationären Aluminiumstangen, indem Sie die Lautsprechersockel in gleichmäßig verteilten kreisförmigen Löchern platzieren. Schneiden Sie in die Stangen und stabilisieren Sie jeden Lautsprecher, indem Sie eine Schraube durch die Seite der Aluminiumstange in jedes kreisförmige Loch einführen. Verbinden Sie dann die einzelnen Lautsprecher mit dem Wahlschalter, indem Sie Drähte an die positiven und negativen Eingänge am Lautsprecherkörper und an die entsprechenden Ausgänge am Wahlschalter anschließen.

Der Lautsprecherwähler ermöglicht es, dass das Signal vom Funktionsgenerator nach dem Durchlaufen einer Endstufe alle acht Lautsprecher gleichzeitig erreicht. Platzieren Sie dann die beiden Kammer-Arrays, den Lautsprecherwähler und die zugehörige Elektronik in einem Anti-Feuchtigkeitsgehäuse, in dem die gesamte Baugruppe in einem kommerziellen Zellkultur-Inkubator untergebracht ist. Führen Sie die Hauptkabel durch ein Stück PVC-Schlauch in medizinischer Qualität und schließen Sie den Leistungsverstärker und den Lautsprecherwähler durch die Filterbaugruppe an der Rückseite des Inkubators an.

Um den Bioreaktor zu charakterisieren, geben Sie zunächst 1,5 Milliliter Wasser in die Vibrationskammer, um das PCL-Gerüst vor der Vibration zu hydratisieren. Führen Sie dann mit dem Funktionsgenerator Vibrationssignale in die Sandwich-Acrylkammer ein. Verwenden Sie ein Voltmeter genau.

Messen Sie die Spannung an jedem Lautsprechereingang und montieren Sie dann die Einpunkt-Laserdoppler-Schwingung. Befestigen Sie den faseroptischen Lasersensor. Gehen Sie zu einem Schwenk-Neige-Kopf-Stativ und winkeln Sie den Sensorkopf so an, dass er senkrecht zur Tischplatte zeigt.

Verbinden Sie dann den Sensorkopf über ein Koaxialkabel mit dem Datenerfassungsmodul und das Modul über den USB-Anschluss mit einem Laptop. Fokussieren Sie den Laserstrahl senkrecht auf verschiedene vorgegebene Punkte auf der Silikonmembran und klicken Sie dann mit der Datenerfassungssoftware im Optionsmenü auf Erfassungseinstellungen. Ändern Sie als Nächstes den Messmodus in FFT und klicken Sie dann auf das Werkzeug für kontinuierliche Messungen in der Hauptsymbolleiste.

Klicken Sie auf den Peak, der sich bei der gewählten Frequenz bildet, um die Verschiebung aufzuzeichnen und die normale Verschiebung der mittleren Membran als Funktion der relativen Position auf dem Substrat darzustellen. Zur Einrichtung einer Vibrationszellkultur werden zunächst aus dem menschlichen Knochenmark gewonnene mesenchymale Stammzellen in T one 50 subkultiviert. Gewebekulturflaschen mit einer anfänglichen Aussaatdichte von vier bis fünf mal 10 bis drei Zellen pro Quadratzentimeter in Erhaltungsmedien für sieben bis acht Tage am Tag vor dem Experiment immersives Ein PCL-Gerüst in 70% Ethanol über Nacht.

Am nächsten Morgen lösen Sie die Zellen mit Accutane ab und schleudern Sie die Zellen herunter und resuspendieren Sie das Pellet in frischen Erhaltungsmedien in einer Konzentration von 4,5 mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter. Nachdem das Ethanol verdampft ist, setzen Sie beide Seiten des Gerüsts fünf bis acht Minuten lang keimtötendem UV-Licht aus. Weichen Sie dann das PCL-Gerüst nach einer Stunde in einer Fibronektinlösung mit 20 Mikrogramm pro Milliliter bei 37 Grad Celsius ein.

Der Bioreaktor wird, wie gerade demonstriert, und dann gleichmäßig 40 Mikroliter der Zellsuspension auf das gesicherte Gerüst verteilen. Lassen Sie die Zellen ein bis 1,5 Stunden lang anheften und geben Sie dann weitere 1,5 Milliliter frisches Medium in die Vibrationskammer. Nachdem Sie das mit mesenchymalen Stammzellen beladene PCL-Gerüst drei Tage lang statisch kultiviert haben, aktualisieren Sie das Medium und legen Sie dann die ausgewählten Vibrationsregime auf die zellulären Konstrukte auf.

Die Schwingungsfrequenzen werden so gewählt, dass sie die grundlegenden menschlichen Sprechfrequenzen widerspiegeln, und es besteht eine lineare Beziehung zwischen der normalen Verschiebung und der Spitzenspannung im Bereich von null bis 0,125 Volt für alle Frequenzen, die bei einer gegebenen Spitzenspannung getestet werden, die normale Verschiebung nimmt ab, wenn die Frequenz von 100 auf 300 Hertz zunimmt. Zelluläre Reaktionen auf vibratorische Stimulationen, die auf mRNA-Ebene in Bezug auf die Expression der essentiellen Stimmlippe untersucht werden. Extrazelluläre Matrixproteine wie die Elastin-Hyaluronan-Synthase eins, die Kollagen-Typ-3-Alpha-Synthase und die Matrix-Metalloproteinase eins zeigen, dass die zyklische Vibration von einer Stunde auf eine Stunde ohne Vibration zu einer 2,3-fachen Steigerung der Elastin-Expression im Vergleich zu den statischen Kontrollen führt.

Am siebten Tag erhöhen die vibratorischen Stimulationen auch die Kollagenexpression moderat. Es ist bemerkenswert, dass die Expression der wichtigsten extrazellulären Matrix-Remodeling-Enzyme, der Hyaluron-Synthase eins und der Matrix-Metalloproteinase eins, durch die Schwingungssignale vom dritten bis zum siebten Tag signifikant erhöht wird. Dynamisch kultivierte Zellen produzieren 4,2 plus oder minus 0,1 Mikrogramm pro Milligramm pro Trockengerüst mit dem Gewicht lösliches Elastin, wie von Elisa nach sieben Tagen Vibration nachgewiesen wurde.

Während die statischen Kontrollen nur 2,7 plus oder minus 0,2 Mikrogramm pro Milligramm Elastin akkumulieren. Im Durchschnitt führen Vibrationen an sieben Tagen, eine Stunde bei einer Stunde Pause zu einem 2,2- bzw. 4,7-fachen Anstieg im Vergleich zu den entsprechenden statischen Kontrollen bei Hyaluronsäure bzw. MMP um eine Sekretion. Obwohl unser System für die Untersuchung der Physiologie der VOCO-Form konzipiert ist, kann es auch auf viele andere Systeme angewendet werden.

Zum Beispiel Ohr- und menschliches Hautgewebe. Danke fürs Zuschauen. Viel Glück bei Ihren Experimenten.