A طريقة Permeabilization من

الهدف العام من التجربة التالية هو تحضير أجنة ذبابة الفاكهة drosophila حيوية ذات قشرة بيضة نفاذة لاختبار النشاط الحيوي للأدوية الجزيئية الصغيرة أو السموم التي يتم إدخالها. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال معالجة الأجنة في مراحل نموها بمحلول مبيض مخفف لإزالة طبقات قشرة البيضة الكوريونية الخارجية. وتتمثل الخطوة الثانية في جعل الأجنة نفاذة باستخدام مذيب يعمل على استنفاد طبقة قشرة البيضة الشمعية الرقيقة التي تمنع نفاذ المذابات الجزيئية الصغيرة.

تتمثل الخطوة الثالثة في معالجة الأجنة بعقار أو سم وصبغة لتقييم نفاذية قشرة البيضة وفي الوقت ذاته إدخال المركب المراد دراسته. وبعد مزيد من النمو، يمكن تصوير الأجنة مباشرة أو معالجتها لإجراء الكيمياء النسيجية المناعية. وفي النهاية، يمكن أن تظهر النتائج تأثير العقار أو السم على تطور الأنسجة، كما يتم تحديده بواسطة المجهر الفلوري باستخدام كواشف مناعية أو صبغات حيوية.

سأعرض اليوم طريقتنا في نفاذية أجنة ذبابة الدروزوفيلا (drosophila) من أجل اختبارات نشاط الجزيئات الصغيرة. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل استخدام المذيبات العضوية التقليدية مثل الهبتان لنفاذية قشرة البيضة، في أن مذيب نفاذية الأجنة الخاص بنا، أو EPS، قابل للامتزاج بالماء وغير سام نسبياً.

تسهل هذه الخصائص معالجات الأجنة بحيث يمكن التحكم في التعرض للمذيبات بدقة أكبر، كما يمكن إجراؤها في أوساط ذات صلة فسيولوجياً، وكلا الأمرين يؤديان إلى زيادة حيوية الأجنة. لقد خطرت لي فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنت أفكر في كيفية إزالة الطبقة الشمعية لقشرة البيضة. وبحكم ممارستي لرياضة التزلج، تأملت في الاستخدام الشائع لمذيب الحمضيات لإزالة الشمع المتبقي من قاعدة الزلاجات.

دفعني هذا إلى نقل هذا التطبيق إلى قشرة بيضة جنين الذبابة، وبعد بعض التجارب والخطأ أدى ذلك إلى تحديد تكوين الـ EPS. قم بتجهيز أقفاص التكاثر التي تحتوي على 500 ذبابة على الأقل في سن التزاوج من السلالات المطلوبة. يجب أن تكون الأقفاص مزودة بـ 10 centimeter من عصير العنب. يتم التهوية باستخدام لمسة من معجون الخميرة.

قم بتغيير هذه الأطباق مرتين يومياً. بعد بضعة أيام، ستتكيف الذباب مع المزرعة وتضع الأجنة بشكل أكثر انتظاماً. يتكون EPS من مواد خافضة للتوتر السطحي ومحاليل مذيبات محدودة، وهو صالح لمدة شهرين.

عند التخزين في درجة حرارة الغرفة، يتم تدفئة المواد الخافضة للتوتر السطحي إلى 37 درجة Celsius عند تحضير محلول EPS طازج. وبالنسبة لمعالجة EPS، يتم التعامل مع الأجنة باستخدام سلال مصنوعة من أنابيب بولي بروبيلين سعة 50 milliliter مقطوعة بطول ثلاثة centimeter وشبكة نايلون خشنة؛ حيث تذوب الحواف البلاستيكية في الشبكة بسهولة أكبر خلال خطوات التطوير اللاحقة. كما يتم التعامل مع الأجنة أيضًا باستخدام سلال مصنوعة من أغطية أنابيب سعة 50 milliliter.

يتم ثقب الغطاء وعمل حز فيه، وتعمل السن اللولبية بين الغطاء والأنبوب على تثبيت الشبكة. بدلاً من ذلك، تُستخدم حجرة انزلاق مصنعة محلياً ويتم تجهيزها بقطعة من غشاء نفاذ للأكسجين يتم تثبيته فوق الفتحة بواسطة حلقة تثبيت لجمع الأجنة.

ضع طبق عنب جديداً يحتوي على عجينة خميرة فوق المزرعة في الصباح. بعد مرور ساعة، استبدل الطبق وتخلص من الطبق الأول الذي تم تجميعه. اترك الطبق الثاني لتجميع الأجنة لمدة ساعتين عند 25 درجة Celsius.

بعد ذلك، قم بجمع الطبق ونقله إلى درجة حرارة 18 درجة Celsius. واترك الأجنة لتتطور حتى المرحلة المطلوبة. وعندما تصبح الأجنة جاهزة، قم بإزالة الغشاء المحيط بها قبل البدء بمعاملة EPS.

اشطفها من الطبق إلى سلة الهرس باستخدام الماء وفرشاة طلاء. ثانياً، اشطفها تحت تيار مائي خفيف لإزالة أي بقايا. ثالثاً، اغمرها في bleach بتركيز 50% لمدة دقيقتين مع تحريك محلول bleach بشكل دوري.

ثم اشطفها على الفور بالماء الجاري. الآن، املأ ستة أطباق بقطر 60 ملم بـ 10 مليلتر من PBS لتعمل كحمامات غسيل، وقم بإجراء تخفيف بنسبة 1:40 من مخزون EPS في MBIM مع تحريك الخليط. سيتكون مستحلب أبيض؛ جفف الماء الزائد من قاع سلة الشبكة باستخدام منديل ورقي، ثم اغمر الأجنة في تخفيف EPS مع الاستمرار في حركة التحريك.

بعد تحريك الأجنة في محلول EPS لمدة 30 ثانية، قم بإزالتها وتجفيف المحلول الزائد. بعد ذلك، انقل السلة بين أحواض PBS الستة، مع الرش بلطف للشطف، ثم ابدأ بمعالجة الصبغة والعقار. ويعد تحسين النفاذية والحيوية الجزء الأكثر تعقيداً في هذا البروتوكول.

تتأثر النفاذية بمرحلة نمو الجنين. كما يمكن أن تختلف درجة الحرارة التي يتم عندها تعتيق الأجنة بشكل كبير بين سلالات الذباب الفردية. لذا، يجب تحديد أفضل المعايير لتخفيف EPS ومدة التعرض تجريبياً.

أولاً، قم بتحضير محلول بتركيز 50 micromolar من صبغة sci-fi carboxylic acid في M-B-I-M-T، ويكفي تحضير حجم 1 milliliter في أنبوب microfuge. يمكن إضافة سم أو عقار في هذه المرحلة لإجراء العلاجات الحادة، ثم استخدم جهاز vortex للخلط. انقل الأجنة النفوذة من السلة إلى أنبوب microfuge باستخدام فرشاة رسم.

أغلق الأنبوب بالغطاء واقلبه عدة مرات. ثم ضع الأنبوب على جهاز التحريك (mutator) واتركهما في الحاضنة لمدة 15 دقيقة. بعد استقرار الأجنة، قم بإزالة الصبغة باستخدام ماصة وأضف مللتر واحد من M-B-I-M-T للغسل.إعادة التعليق.

قم بتعليق الأجنة، واتركها تترسب ثم استبدل M-B-I-M-T. بعد ذلك، كرر هذه العملية للمرة الثالثة والرابعة. وبمجرد اكتمال الغسل الرابع، قم بإزالة كل M-B-I-M-T وانقل الأجنة إلى سلة تنمية لفترات التنمية الطويلة.

بالنسبة لسلة التطوير أولاً، قم بتجهيز السلة بشطفها بـ 70% ethanol ثم بماء مقطر (di water)، وجففها باستخدام منديل مختبري. عند الانتهاء، انقل السلة إلى طبق بقطر 60 مليمتر يحتوي على ستة مليلترات من وسط الحضانة الذي يحتوي على الدواء أو السم المطلوب.

انقل الأجنة إلى الشبكة الموجودة في السلة باستخدام فرشاة رسم عن طريق إسقاط وسط الحضن فوقها بلطف، ثم وزع الأجنة في طبقة واحدة. احرص على عدم حبس فقاعات الهواء تحت الشبكة. لاستخدام غرفة الشرائح أولاً، قم بتجهيز الغرفة، ثم اقلب غرفة الشرائح وضع طبقة رقيقة من شحم الفراغ حول حافة الفتحة.

بعد ذلك، قم بتحميل 150 µL من الوسط المطلوب على سطح غشاء do داخل الفتحة. الآن، انقل الأجنة إلى الأوساط باستخدام فرشاة رسم ووزعها فوق الغشاء. وأخيراً، قم بوضع غطاء شريحة دائري بقطر 25 mm لتسطيح الوسط.

قم بتطبيق ضغط خفيف حول المحيط لضمان الإحكام. هناك تأثير قوي لتربية الأجنة عند 18 °C على قدرتها على النفاذ بواسطة EPS وامتصاص الصبغة في المراحل المتأخرة من النمو. ويتضح ذلك من غياب امتصاص Rumine BD في الأجنة المعالجة بـ EPS التي ربيت عند 25 °C، بينما يكشف امتصاص صبغة حمض الكربوكسيليك sci-fi، الموضح هنا باللون الأحمر، عن مستويات النفاذية المختلفة التي تظهر عادةً في الأجنة المعالجة بـ EPS.

يكشف التوزيع الديناميكي لصبغة sci-fi ذات اللون الأحمر البعيد أثناء النمو، وتمركزها في المح في الأمعاء النامية التي تظهر بفلورة ذاتية زرقاء، عن معيار يُستخدم لتقييم الحيوية. كما يمكن لصبغة sci-fi تحديد نفاذية الجنين السابقة بعد التثبيت بالفورمالديهايد والتلوين المناعي. بعد معالجة أجنة EPS بصبغة sci-fi وسم ميثيل الزئبق، يتم تلوينها بـ Antifa two الذي يظهر باللون الأخضر لتمييز العصبونات الحركية، و anti E lab باللون الأحمر لتمييز أجسام الخلايا العصبية.

تم تلوين صبغة Sci-fi بلون أزرق اصطناعي. يؤثر ميثيل الزئبق على نمط أجسام خلايا عصبونات cortone المحددة بالأسهم في أجنة مجموعة الضبط. تمتلك هذه العصبونات حزمة أكثر ترتيباً؛ حيث يوضح الشكل الموضح هنا باللون الأبيض التفرع الطبيعي للعصبونات القطعية في مجموعة الضبط كما تشير رؤوس الأسهم.

بالمقارنة، تؤدي المعالجة بميثيل الزئبق إلى تغيير نمط التفرع كما تشير الأسهم الخضراء المصمتة. ويشير السهم الأخضر المفرغ إلى الموضع الذي حدث فيه إزاحة للتفرع. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إجراء معالجات نفاذية الجنين في غضون 30 أو 40 دقيقة إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التثبيت والتلوين المناعي للأجنة للإجابة على أسئلة إضافية، مثل تحديد الأنسجة النوعية التي يستهدفها دواء أو سم ما أثناء النمو. أشكركم على مشاهدة هذا الإجراء وأتمنى لكم كل التوفيق في تطبيق هذه الطرق في مختبراتكم.