Identification rapide des bactéries à Gram négatif de sang Bouillon de culture à l'aide MALDI-TOF spectrométrie de masse

L’objectif global de cette procédure est d’identifier les organismes à Gram négatif directement à partir du bouillon d’hémoculture en utilisant la technologie maloff pour ce faire, cinq millilitres d’un bouillon d’hémoculture positif sont transférés dans un tube de séparation du sérum et centrifugés. Après l’essorage, la couche fluide contenant des bactéries est transférée dans un micro-tube de centrifugation, puis centrifugée à basse vitesse. Le surnageant est ensuite transféré dans un nouveau microtube de centrifugation et centrifugé à grande vitesse.

La pastille obtenue est remise en suspension dans de l’acide formique et analysée par maldi afin d’identifier les espèces de bactéries présentes. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la culture traditionnelle, est l’identification plus précoce des bactéries à Gram négatif. Les implications de cette technique s’étendent à la microbiologie clinique car un diagnostic de bactériémie impacte le choix de l’antimicrobien prescrit par le clinicien.

La démonstration de cette procédure sera assurée par Leonardo Bascu, l’un des techniciens de notre département qui effectue régulièrement cette procédure. Les flacons d’hémoculture aérobie ou anaérobie prélevés à la discrétion du personnel clinique, généralement dans le cadre d’une maladie fébrile, sont incubés dans des machines automatisées qui surveillent en permanence la croissance des bactéries. Lorsqu’il y a des signes de croissance dans un flacon d’hémoculture, l’appareil identifie le flacon signalé.

Commencez cette procédure en retirant le flacon d’hémoculture signalé de l’incubateur. Placez-le dans une enceinte de sécurité biologique. Préparez une coloration de Gram à partir du bouillon d’hémoculture signalé conformément aux protocoles institutionnels locaux, et examinez-la au microscope si des organismes à Gram négatif sont identifiés.

Traitez le bouillon de culture en suivant la méthode décrite ici. Si des organismes à Gram positif sont identifiés, une autre méthode de molecular rapide peut être utilisée. Retournez le flacon d’hémoculture deux à trois fois pour mélanger.

Puis dans l’enceinte de biosécurité. Fixez une seringue de 10 millilitres à un dispositif de transfert sanguin de sécurité. Fixez le dispositif de transfert sanguin à la bouteille d’hémoculture et prélevez cinq millilitres de bouillon dans le transfert de seringue.

Le bouillon d’hémoculture aspiré dans une centrifugeuse à tube de séparation du sérum à 1, 250 fois G pendant 15 minutes pour éliminer les globules rouges. Après la rotation, l’hémoculture des bouteilles d’aérobie montre une séparation claire des globules rouges au fond du tube, l’interface du fluide de gel apparaissant sous la forme d’une couleur blanche opaque. En revanche, l’hémoculture de l’hémoculture anaérobie lytique apparaît sous la forme d’une couleur rouge foncé à l’interface du fluide de gel.

Étant donné que les composants des globules rouges lysés restent en suspension dans le surnageant pour l’un ou l’autre type, aspirez et jetez le surnageant à l’aide d’une pipette de transfert stérile, en prenant soin de laisser environ un millilitre de couche leucocytaire immédiatement au-dessus de l’interface gel-fluide. Ensuite, à l’aide d’une pipette stérile, mélangez doucement le dernier millilitre de liquide leucocytaire au-dessus de l’interface du gel, puis transférez tout le volume dans un microtube à centrifuger. Faites tourner le nouveau tube à 288 fois G pendant 30 secondes à l’aide d’une pipette de transfert en plastique jetable d’un millilitre.

Transférez le surnageant dans un nouveau microtube à centrifuger et jetez le tube avec la pastille. Il est essentiel dans cette étape d’éviter de transférer la pastille. Ceci est particulièrement important dans les échantillons d’hémoculture anaérobie, car le supinat reste pigmenté et la pastille n’est pas toujours clairement visible.

Centrifugez l’échantillon à 18, 407 fois G pendant une minute, puis à l’aide d’une pipette de transfert à pointe fine, aspirez et jetez le surnageant pour laisser le moins de liquide résiduel possible sans perturber la pastille. Ajoutez un millilitre d’ADN stérile et d’eau libre d’ARN et pipetez de haut en bas pour remettre en suspension la centrifugeuse à granulés résiduelle. La solution remise en suspension à 18, 407 fois G pendant une minute.

Après la centrifugation, à l’aide d’une pipette à pointe fine, aspirer et jeter le surnageant. Encore une fois, en prenant soin d’enlever le plus de liquide possible. Remettre le granulé en suspension dans 10 microlitres d’acide formique à 70 %.

Pour les grosses pastilles, il peut être nécessaire d’augmenter le volume d’acide formique de 50 à 100 %À l’aide de la pipette, mélangez bien pour assurer une solution homogène si nécessaire, utilisez la pointe de la pipette pour perturber physiquement la pastille. La solution résultante contient des bactéries concentrées isolées du bouillon d’hémoculture, qui est relativement exempt de cellules humaines et d’hémoculture. À l’aide d’une pipette, inoculer, une plaque cible propre de maldi TOF avec deux microlitres de la suspension préparée par point cible. Préparez trois sites cibles pour chaque échantillon afin de résoudre le problème occasionnel des échecs de lecture.

Placez la plaque sur le bord de la hotte pour maximiser la circulation de l’air à travers celle-ci afin qu’elle sèche rapidement, recouvrant chaque endroit séché d’un microlitre de solution matricielle. Laissez sécher la plaque maldi sur le bord de la hotte. Comme précédemment, assurez-vous qu’une préparation homogène remplit chacun des points cibles sur la plaque.

Insérez la plaque cible dans le spectromètre de masse maloff. Assurez-vous que la plaque est alignée avec les plaques à ressort. N’insérez pas la plaque cible tant que tous les points cibles ne sont pas secs.

Vérifiez le joint en caoutchouc pour vous assurer qu’il est exempt de peluches, de poussière et de cheveux. Cela permettra de créer les conditions de vide requises. Ensuite, fermez le couvercle de la platine maloff, puis appuyez sur le bouton d’entrée-sortie situé à l’avant de l’instrument.

Le couvercle se verrouille et un vide se crée. Ouvrez le logiciel de contrôle maldi typ et flex dans le logiciel typ. Dans le menu déroulant intitulé fichier, sélectionnez nouvelle classification, nommez le projet, puis sélectionnez nouveau.

Sélectionnez Suivant. Pour terminer la configuration dans la fenêtre du logiciel de contrôle flexible, identifiez le graphique à l’écran de la plaque cible tout en maintenant le bouton gauche de la souris enfoncé. Passez la souris sur les points inoculés et mettez en évidence les points cibles utilisés.

Utilisez le bouton droit de la souris pour cliquer n’importe où sur les positions cibles sélectionnées, puis sélectionnez Ajouter des analytes dans le menu déroulant. Pour chacun des points cibles, ajoutez les détails d’identification de l’hémoculture dans la colonne ID et cliquez sur suivant. Une fois terminé, sélectionnez la base de données de spectres de taxonomie commerciale et sélectionnez les laboratoires suivants qui peuvent utiliser des bases de données internes ou commerciales supplémentaires pour augmenter le nombre de spectres de référence, cliquez sur terminer et le MALDI TOF MS commencera à générer des spectres.

Parfois, des scores de maldi plus élevés peuvent être obtenus en utilisant l’acquisition manuelle de maldi en spectres dans le logiciel de contrôle de flexion. Une fois les spectres acquis et l’analyse terminée dans le logiciel de stéréotypage, sélectionnez le bouton plus à côté de l’identification de l’espèce. Pour élargir la liste d’identification de chaque cible, étudiez les cinq principales identifications en notant si les cinq premières sont similaires.

Si les cinq premiers genres sont discordants avec des scores supérieurs ou égaux à 1,7 pour le même point cible, un mélange d’espèces peut être présent. Notez que la technologie OV a une faible sensibilité pour la détection d’espèces mixtes. Lorsqu’un score supérieur ou égal à 2,0 est noté pour la correspondance la plus élevée sur une tache cible, déclarez l’espèce lorsque le score le plus élevé sur une tache cible est supérieur ou égal à 1,7, mais inférieur à 2,0, déclarez le gène.

Ce n’est que si les critères supplémentaires des cinq premières identifications sont concordants que l’on peut faire rapport au niveau de l’espèce. Lorsque tous les spectres sont terminés, appuyez sur le bouton d’entrée-sortie du MALDI pour usiner, ouvrez le réceptacle de la plaque cible et retirez la plaque. Si vous utilisez une plaque cible réutilisable Maldi TOF, utilisez de l’alcool pour nettoyer tous les endroits cibles et conservez le maldi sur plaque à température ambiante une fois qu’il est propre et sec pour identifier les bactéries à Gram négatif dans le bouillon d’hémoculture, des cycles d’essorage ont été utilisés pour concentrer et isoler les bactéries, qui ont ensuite été analysées par spectroscopie de masse MALDI TOF.

Comme décrit dans cet article vidéo, voici les spectres générés par MALDI TOF MS pour eureka coli avec un score logarithmique de 1,86. L’une à droite sont les cinq premières correspondances identifiées par le logiciel de dactylographie. Il est à noter que l’espèce est systématiquement signalée comme re coli avec un score de 1,861.

Étant donné que les cinq premières correspondances sont des e coli, l’identification est considérée comme fiable au niveau de l’espèce. Les spectres générés par MALDI à MS pour Pseudomonas aerogen sont présentés ici. Le score logarithmique est de 2,216 à droite sont les cinq premières correspondances identifiées par le logiciel de dactylographie.

Il est à noter que l’espèce est systématiquement signalée sous la forme de Pseudomonas aerogen avec un score élevé de 2,216. L’identification est considérée comme fiable au niveau de l’espèce. Les spectres générés par MALDI à MS pour un bouillon d’hémoculture mixte contenant de l’esia coli et du SIO marsens sont montrés ici à droite sont les cinq premières correspondances par le logiciel de typage, qui signale à la fois Reiki coli et SIO marsan.

Dans les cinq premiers spectres appariés. Ce gène mixte n’est identifié que dans environ un tiers des cultures de bouillon mixte. Ce tableau résume les résultats précédemment publiés de l’étude de vérification de cette méthode dans laquelle 91,8 % des bouillons monomicrobiens ont obtenu un score de maldi inférieur à 1,7 avec une concordance de 100 % et 97 % avec respectivement le génie et l’espèce.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon de préparer une bouteille d’hémoculture de signal pour l’identification à l’aide de Maldi Toff. En suivant cette méthode, nous pouvons utiliser la même pastille préparée pour l’identification bactérienne afin de préparer un inoculaire plus standardisé pour les tests de sensibilité automatisés. Par exemple, cette technique permet aux laboratoires de fournir un diagnostic précoce aux cliniciens avec un potentiel d’impact sur la prise en charge.

N’oubliez pas que travailler avec des bouteilles d’hémoculture peut être dangereux et que des précautions, y compris une enceinte de sécurité biologique, doivent toujours être utilisées lors de la manipulation des bouteilles d’hémoculture.