Un procedimiento de volumen pequeño para la concentración viral del Agua

El objetivo general del siguiente experimento es optimizar la recuperación de virus del agua. Utilizando una técnica a pequeña escala diseñada originalmente para optimizar las concentraciones de virus. Se descubrió que un filtro de celulosa de vidrio era el mejor filtro electropositivo para concentrar el adenovirus del agua para la elución secundaria.

Una técnica de concentración secundaria de luz marina demostró ser la mejor para eludir el adenovirus de las superficies del filtro. El resultado en la técnica recupera la mayor cantidad de adenovirus del agua del grifo en función de tener el mayor porcentaje de recuperaciones observado entre todas las combinaciones de filtro y elución probadas. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la concentración de volumen a gran escala, es que utiliza volúmenes de muestra más pequeños, lo que permite evaluar una multitud de variables de concentración de forma rápida y sencilla.

Al prepararse para este protocolo, tenga a mano todas las soluciones necesarias, incluida la solución viral filtrada de 22 micras a 10 a 100.000 MPN por mililitro. Comience midiendo un litro de agua del grifo estéril. Transfiéralo a un vaso de precipitados de dos litros con una barra magnética mientras revuelve el agua.

Añade 0,7 gramos de tio sulfato de sodio y deja que se disuelva por completo. A continuación, ajuste un pH entre siete y 7,5 añadiendo un ácido molar en las soluciones madre de la bahía gota a gota. A continuación, agregue el agua con virus.

Agregue un mililitro completo de la solución de virus preparada. Cubra el matraz con una envoltura estéril y deje que el virus se mezcle con el agua durante 10 minutos. Mientras tanto, prepare primero el filtro de miliporos, desenvuélvalo de su empaque y asegúrese de que esté bien ajustado entre el recipiente superior y la pantalla inferior.

A continuación, compruebe que el material de corcho del filtro encaja perfectamente en el borde de un matraz de brazo lateral de un litro. Ahora retire el recipiente superior del filtro y, con pinzas, coloque un disco de filtro electropositivo de 47 milímetros directamente sobre la pantalla del filtro. Luego vuelva a colocar el tazón y asegúrelo en su lugar con un giro en sentido contrario a las agujas del reloj.

Mida 100 mililitros de agua del grifo con un cilindro estéril. A continuación, transfiera el agua a la carcasa del filtro preparada en el matraz de dos litros. El disco electropositivo en el filtro puede ser de celulosa de vidrio plisada o fibra de vidrio nano Illumina, se puede usar un vacío suave para hacer pasar el agua residual a través del filtro.

Ahora, mueva la carcasa del filtro a un matraz de brazo lateral de 250 mililitros. Mide 100 mililitros de extracto de carne de res y viértelo lentamente en el filtro. Deje que el extracto pase lentamente y use una aspiradora suave para extraer el residuo.

A continuación, proceda con cualquiera de las dos opciones de concentración secundaria para concentrar el virus utilizando la luz del mar. Transfiera el contenido del matraz de 250 mililitros, que contiene el virus, a una placa de agitación. Con una barra de agitación, crea un pequeño vórtice.

A continuación, agregue 0,1 gramos de polvo de cite a 100 mililitros de extracto de carne de res. Deje que la luz C se disperse y prepárese para ajustar el pH de las soluciones utilizando adiciones gota a gota de ácido clorhídrico 0,1 molar. Baja el pH a 4.0.

Luego deje que la solución se mezcle durante 10 minutos mientras mezcla. Coloque su prefiltro de 47 mililitros en un matraz de dos litros. Ahora vierta 100 mililitros de la mezcla de extracto de carne de mar a través del prefiltro.

Se puede usar un ligero vacío para terminar. A continuación, coloque un clip de tubo de metal en el extremo de la boquilla de la carcasa del filtro hasta el clip. Coloque un tubo colector de polipropileno estéril de 15 mililitros y luego vuelva a montar el filtro en el matraz.

Ahora eluye el virus del mar Partículas ligeras en cinco mililitros de un XPBS a pH nueve. Permita que la mayor parte del PBS gotee a través del tubo de 15 mililitros por gravedad y extraiga el residuo con un vacío ligero para concentrar el virus mediante floculación orgánica. Transfiera el contenido del matraz de 250 mililitros que contiene el virus a una placa de agitación.

Con una barra de agitación, cree un pequeño vórtice, ajuste el pH de la solución a 3,5 utilizando adiciones gota a gota de un molar de ácido clorhídrico. Luego deje que la mezcla revuelva durante media hora más tarde. Transfiera la solución a un tubo centrífugo cónico estéril de 250 mililitros.

Centrifugar la solución a 2.500 g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados después del centrifugado. Tenga cuidado de no dañar el pellet cuando manipule los tubos con cuidado. Para enlatar el snat y resuspender el pellet en cinco mililitros de PBS pH nueve.

Asegúrese de que el palet esté disuelto. A continuación, centrifugar el Resus a 4.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Ahora recoge el sobrenadante que contiene el virus concentrado.

El pellet se puede desechar. Al optimizar este protocolo, se compararon tres tipos de luz marina más grandes. La luz del mar dio lugar a una menor recuperación tanto de un DV 40 como de un DV 41.

La elución del filtro se probó a PHS entre 7.5 y 12 para determinar cuál sería el más efectivo para recolectar partículas DV de los filtros. La mayor recuperación se obtuvo de un filtro de celulosa de vidrio acoplado a extracto de carne de vacuno a pH 10 y con luz de mar. El resultado fue el mismo con un DV 40 y un DV 41.

El extracto de carne de vacuno a pH 10 demostró ser superior a la floculación orgánica. El método optimizado se comparó con la adición de tripsina al 25% y se comparó con la suplementación del extracto de carne de vacuno con polifosfato de sodio al 0,1%. El tratamiento mejoró significativamente.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 45 minutos si se realiza correctamente.