Ein Video-Protokoll von retrovirale Infektion in der Grunddarm Organoide Kultur

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu demonstrieren, wie funktionelle genetische Studien an Organoiden durchgeführt werden können. Dies wird erreicht, indem die Organoide zunächst mit WINT drei A haltigen Medien vorbehandelt werden, um ihnen die Annahme einer zystischen Form zu erleichtern und ihre Stammzellzahlen zu erhöhen. Im zweiten Schritt wird das Virus hergestellt und die Organoid-Fragmente werden anschließend transduziert und geimpft.

Im letzten Schritt werden die transfizierten Organoide platziert und dann für eine stabile virale Integration selektiert. Letztendlich kann die Expression oder Unterdrückung des interessierenden Gens durch GFP-Fluoreszenz beurteilt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden AL-Modellen wie der Maus besteht darin, dass mit dieser Technik funktionelle genetische Experimente in vitro mit den Darmorganoiden durchgeführt werden können.

Amanda Andro, eine Doktorandin aus meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Um die Krypten zu isolieren, beginnen Sie mit dem Waschen des Dünndarms mit vorgekühltem kalzium- und magnesiumfreiem PBS. Schneiden Sie dann das Taschentuch in drei bis fünf Zentimeter lange Stücke und öffnen Sie die Stücke mit einer Schere in Längsrichtung. Spreizen Sie das Gewebe mit einer Pinzette, kratzen Sie überschüssige Zotten mit einem Deckglas ab und geben Sie die Stücke dann in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit gekühltem PBS.

Waschen Sie die Gewebefragmente zwei- bis dreimal unter kräftigem Schütteln, wechseln Sie das PBS, bis das PBS nach dem letzten Waschen weniger trüb wird, und inkubieren Sie das Gewebe in einem 50-Milliliter-Röhrchen mit 30 Millilitern PBS, ergänzt mit einem Millimolar EDTA bei vier Grad Celsius auf einer Röhrchenwalze. Schütteln Sie das Röhrchen nach 30 Minuten erneut kräftig und übertragen Sie das Gewebe in ein weiteres 50-Milliliter-Röhrchen, das 30 Milliliter PBS enthält, das mit fünf Millimolaren EDTA ergänzt ist. Nach einer Stunde Inkubation bei vier Grad Celsius auf der Röhrenwalze kräftig aufdrehen.

Schütteln Sie das Röhrchen erneut und geben Sie die Lösung in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen. Zählen Sie dann die Anzahl der Krypten in 50 Mikrolitern. Berechnen Sie das Volumen mit 50 bis 100 Krypten und übertragen Sie es in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Als nächstes schleuderst Du die Krypten herunter und suspendierst das Pellet in 50 Mikrolitern Kellermatrix. Säen Sie dann die Kryptenlösung in eine vorwarme 24-Well-Platte und inkubieren Sie die Platte fünf bis 15 Minuten lang in einem Gewebekultur-Inkubator. Sobald die Basalmembran polymerisiert ist, inkubieren Sie die Matrix mit 500 Mikrolitern ENR-Medium in einem Zellkultur-Inkubator.

Wenn das Medium alle drei Tage, etwa 24 Stunden nach dem Einsetzen, aufgefrischt wird, zeigen die Organoide eine kleine runde zystische Form. Nach weiteren zwei bis drei Tagen werden knospende Strukturen sichtbar, während die Organoide ihre zystische Morphologie annehmen. Seed, etwa fünfmal 10 bis zu den sechs Platin-E-Zellen in einer 150-Millimeter-Schale mit 15 bis 18 Millilitern Medium, ergänzt mit PUR, Mycin und Blastin. Wechseln Sie nach zwei bis drei Tagen das Medium auf Medien ohne Antibiotika und geben Sie 30 Mikrogramm retrovirales DNA-Konstrukt und 240 Mikroliter Pi in zwei einzelne Röhrchen mit jeweils einem Milliliter Optimum.

Mischen Sie anschließend die Röhrchen und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur. Nach fünf Minuten werden die beiden Lösungen in einem Pool zusammengefasst und weitere 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Geben Sie die vollständige Mischung zu den Platin-E-Zellen und schütteln Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung der DNA-PI-Komplexe zu gewährleisten.

Nach einer Inkubation über Nacht wird das Medium aufgefrischt und die Zellen erneut inkubiert. Nach zwei Tagen nur das Medium in einem 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen auffangen und durch einen 0,45-Mikron-Filter abseihen. Zentrifugieren Sie dann die Lösung 12 bis 16 Stunden lang bei 8.000 G und vier Grad Celsius und resuspendieren Sie das Pellet in 250 Mikrolitern Transduktionsmedium.

Um die Organoidfragmente für die retrovirale Transduktion vorzubereiten, pipettieren Sie die Kultur zunächst 30 bis 50 Mal mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze, um die Organoide mechanisch aufzubrechen, die Lösung wird trüb und es sollten keine ganzen Organoide nachgewiesen werden. Nachdem Sie die Fragmente heruntergeschleudert haben, inkubieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern Zellkultur und gradieren Sie rekombinante Protease fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie nach der Inkubation ein Lichtmikroskop, um die Größe der Organoidfragmente zu beurteilen und die Anzahl der Zellen pro Fragment zu zählen.

Fügen Sie dann 500 Mikroliter ENR-Medium hinzu, um den Dissoziationsprozess zu beenden und die Zellfragmente zu schleudern. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, legen Sie das Pellet auf Eis und säen Sie dann die Fragmente in eine Vertiefung von a 48. Vertiefung Platte in 250 Mikroliter der zuvor vorbereiteten retroviralen Lösung.

Mischen Sie die Zelllösung vorsichtig mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze und versiegeln Sie dann die Platte mit Param, um die erste Zentrifuge der Inokulation durchzuführen. Die 48-Well-Platte für eine Stunde bei 600 mal G und 32 Grad Celsius. Entfernen Sie dann vorsichtig die Para-Folie und inkubieren Sie die Platte für weitere sechs Stunden in einem Zellkultur-Inkubator.

Nach der Inkubation werden die infizierten Fragmente in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt. Schleudern Sie dann die Organoid-Fragmente wieder herunter und kühlen Sie das Pellet fünf Minuten lang auf Eis. Sobald das Pellet abgekühlt ist, geben Sie 100 Mikroliter Kellermatrix in das Röhrchen und pipettieren Sie das Pellet langsam auf und ab, um es wieder zu suspendieren.

Säen Sie dann 50 Mikroliter der Fragmentmatrix-Suspension in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für fünf bis 15 Minuten. Nachdem sich die Basalmatrix verfestigt hat, inkubieren Sie die Organoide mit Transduktionsmedien ohne Polyhirn. Nach zwei bis drei Tagen geben Sie reines mycinhaltiges Medium in die Vertiefungen, um die Selektion zu starten. Wenn die Fragmente beginnen, Organoide zu bilden, ersetzen Sie das Transduktionsmedium durch ENR-Medien, die ergänzt werden.

Mit Puram Mycin sind Organoide bereit, gespalten zu werden, wenn ihre zentralen Lumen aufgrund des Vorhandenseins abgestorbener Zellen dunkler werden. Nach zwei bis drei Tagen Wint three a media-Vorbehandlung sollten sich die Organoide an die zystische Morphologie anpassen, wodurch die Anzahl der Stammzellen erhöht und die Chancen auf eine stabile Integration in die Stammzellen erhöht werden. In diesen Bildern ist die Expression des fluoreszierenden Proteins des M-S-C-V-E-G-F-P-Retrovirus in den Zellen zu beobachten, die von den überlebenden Organoiden stammen und innerhalb von zwei bis drei Tagen nach der Transduktion die erwartete zystische Morphologie erhielten.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Größe der Organoidfragmente zu überprüfen, da dies ihre Überlebensfähigkeit stark beeinflusst. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die retrovirale Transduktion von Organoiden durchführt.