Name: במבחנת כינונה מחדש של מכלולי אור קציר של צמחים ואצות ירוקות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: למד כיצד לכונן מחדש מכלולי אור קציר של צמחים ואצות ירוקות במבחנה. השיטה כוללת חילוץ פיגמנטים מעלי תרד וביטוי חלבון APA ב-E. coli לניתוח ספקטרוסקופי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי מועצת המחקר האירופית על ידי מענק התחלתי/קונסולידטור של ERC ל-RC ועל ידי הקרן ההולנדית למחקר על חומר (FOM) באמצעות תוכנית FOM (10TM01).

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים

חלבוני קרום הם לא כל כך קלים ללמוד. בידוד של חלבונים בממברנה ילידים הוא מסובך בשל צורך solubilize bilayer השומנים עם חומרי ניקוי, אשר יכול לגרום נזק לחלבון ולהסיר cofactors החיוני. חלבונים אלו עשויים גם להיות נוכחים ברמות נמוכות בממברנות ביולוגיות, או להיות מעורב עם חלבונים הקשורים באופן הדוק, כמו במקרה של מתחמי קצירת האור, שגורם לטיהור של מתחמים בודדים קשים. ביטוי חלבון Heterologous בE. coli ובכינון מחדש חוץ גופית מציע את האפשרות להימנע מבעיות אלה. במבחנה הכינון מחדש וטיהור של תוצאות חלבונים מקופלות במתחמים שיש להם מאפיינים דומים מאוד לאלו של מתחמי ילידי 20,21,23 ולכן יכול לשמש כדי לחקור מתחמים שלא יכול להיות מטוהר להומוגניות 24 - 27. שיטה זו משתמשת בתרד, אשר בקלות attainabבכל ימות שנה le, כמקור לסך הכנות פיגמנט וקרוטנואידים. עבור חלק reconstitutions של חלבונים האם של אצות, שימוש בפיגמנטים מטוהרים מאצות הוא מועדף בשל יצירות פיגמנט שונות. / היחס ב Chl וChl היחס / מכונית נשארים זהה, ללא קשר למקור פיגמנט. חשוב להבין כי היעילות של הכינון מחדש היא בדרך כלל סביב 35% 28. לכן יש צורך להסיר את הפיגמנטים שאינם כבולים וapoprotein פרש מהפתרון לאחר הכינון מחדש. פרוטוקול טיהור שני שלבים מוצג בפרוטוקול זה (ראה גם תוצאות). עם זאת, יש לציין כי צעד שיפוע סוכרוז אינו מאפשר הפרדת apo- והולו-חלבון המלאה. עבור רוב הניתוחים זה לא בעיה, כפי שapoprotein אינו מכיל פיגמנטים ולכן אינו מפריע למדידות פונקציונליות. עם זאת, במקרה זה יש צורך להסיר apoprotein באופן מלא מfrפעולה המכילה את הקומפלקס מחדש (לדוגמא, כדי לחשב את הפיגמנט לstoichiometry חלבון), ניתן להשתמש בעמודת מטבע אניוני (ראה Passarini et al. 2009 29 לפרטים נוספים). היכולת לקפל חלבוני קצירת אור רקומביננטי עם פיגמנטים מבודדים במבחנה מספק הזדמנות &quot;לתמרן&quot; מתחמים על ידי שינוי &quot;הסביבה&quot; הכינון מחדש בדרכים שונות, וכך לשנות את המאפיינים של המתחם וכתוצאה מכך. לדוגמא, שינוי בהרכב פיגמנט במהלך הכינון מחדש יכול לגרום מורכב עם הרכב פיגמנט שונה. תכונה זו יכולה להיות מנוצלת כדי ללמוד את ההשפעה שיש לי פיגמנטים שונים על המבנה והיציבות של המתחם. בדרך כלל הכנת פיגמנט המתקבלת מתרד יש שיעור כלורופיל / b של 3: 1 וChl יחס / מכונית של 2.9: 1. יחס זה בדרך כלל מייצר חלבון מחדש עם אותם המאפיינים כמו nיצירתי אחד. עם זאת, התאמה של היחס / b Chl על ידי התוספת של Chl מטוהר או ב יכולה להשפיע על הכריכה של פיגמנטים שונים בשל שונה הסלקטיביות של אתרי הקישור 30-33. זה אפשרי משום שרוב אתרי פיגמנט מחייבים הם לא לגמרי סלקטיבית לChl או Chl ב, אבל יכול להכיל את שניהם, אם כי עם זיקה שונה 10,30,34. באופן דומה, אתרי קישור קרוטנואידים הוצגו גם להיות מסוגל להכיל מיני Xanthophyll יותר מאחד 8,35 - 38. reconstitutions שונה של CP26, אחר מורכב פיגמנט חלבון של צמחים גבוהים יותר, תוך שימוש ביצירות פיגמנט שונים מוצג בטבלה 2 39. reconstitutions אלה שמשו כדי להעריך את הזיקה של אתרי קישור לפיגמנטים מסוימים 39. זה מעניין לציין כי על מנת להשיג מורכב עם אותו ג פיגמנטomposition כילידים אחד, Chl היחס / b של תערובת פיגמנט חייב להיות 3: 1. זה נראה להיות מקרה לכל מתחמי LHC של צמחים גבוהים יותר 20,40. השילוב של ביולוגיה מולקולרית עם טכניקת הכינון מחדש מאפשר את התכונות של מורכב Chl מחייב להיחקר ביתר פירוט. החשיבות של תחומים חלבון שונים על היציבות וקיפול של מתחמים, או מעורבותם באינטראקציות בין חלבונים, נקבעה על ידי מקצץ apoprotein או ביצוע mutagenesis האקראי 8,41 - 44. ניתן לשנות שאריות חומצת אמינו בודדת חשובות לתיאום של פיגמנטים שונים דרך מכוון mutagenesis אתר על מנת לנתח את המאפיינים של פיגמנטים בודדים או להעריך את תרומתם לתפקוד והיציבות של 10,28,29,45 המורכבים - 52. איור 6 מראה מחדש Lhcb4 (CP29) עםמוטציה של היסטידין בעמדת 216 53. השוואה של הרכב הפיגמנט של wildtype ומתחמי מוטציה מראה כי המוטציה גורמת לאובדן של אחד Chl מולקולה, המצביע על כך באתר הממוקד להכיל Chl במתחם WT. ההבדלים של ספקטרום הקליטה של ​​WT ומוטציה, על נורמליזציה לתוכן פיגמנט, גם מציג את מאפייני הקליטה של ​​פיגמנט שאבד. במקרה זה, ההבדל שניתן לראות בשיא העיקרי ב680 ננומטר, המצביע על כך Chl מתואם על ידי His216 סופג באורך גל זה (לפרטים נוספים על מוטציה זו והתכונות ספקטרוסקופיות לראות Mozzo et al. 2008 53). גם ניתוח מוטציה יכול לשמש כדי לקבוע את ההשפעה של הסביבה על התכונות ספקטרוסקופיות של פיגמנטים 54. לסיכום, יכולים בקלות להיות משוחזר חלבוני קצירת אור במבחנה וכתוצאה מכך פיגמנט-proteiמתחמי n עם מאפיינים דומים מאוד למתחמי ילידים. בדרך זו, את הקשיים של בידוד חלבוני ילידים בוטלו, גם בעת מתן הכנת חלבון עם תשואה גבוהה וטוהר למחקר נוסף. חשיבותו של יחס 3: / b Chl 1 בהפקת מורכבת אותנטי יודגש, ודוגמאות של wildtype מחדש וLHCs מוטציה ניתנות להמחשת יישומים של הטכניקה.

מנגנון הפוטוסינתזה של צמחים ואצות כוללים חלבונים נפרד קרום שקושרים כלורופיל (CHL), ב (CHL ב) וקרוטנואידים (מכונית). מתחמי פיגמנט החלבון אלה הם פעילים בקצירת אנרגיית אור ומעביר שאנרגיית העירור למרכזי התגובה, שבו נעשה בו שימוש כדי לקדם את תשלום ההפרדה 2. הם גם מעורבים במנגנוני משוב רגולציה המגנים על מנגנון הפוטוסינתזה מפני נזק אור הגבוה 3,4. מתחמי קצירת האור (LHCs) מורכבים ממשפחה גדולה של חלבונים הקשורים בצמחים ואצות 5. הטיהור הומוגנית של כל אחד מבני המשפחה כבר מסובכת על ידי התכונות כימיות ופיסיות דומות מאוד של מתחמים. בנוסף, הליכי טיהור לעתים קרובות לגרום לאובדן של פיגמנטים או cofactors הפוטנציאלי האחר כגון שומנים. במבחנה represen הכינון מחדשts שיטה רבת עוצמה כדי להתגבר על בעיות אלה. LHC הקשורים Photosystem II (LHC-II) הוקם מחדש ראשון במבחנה על ידי Plumley ושמידט בשנת 1987 1. החוקרים שחולצו חלבון ופיגמנטים delipidated בנפרד מכלורופלסטים מפעל, ולאחר מכן בשילוב חלבון החום מפוגל עם פיגמנטים בנוכחות ליתיום Dodecyl סולפט (LDS), ואחריו שלושה מחזורים של הקפאה להפשרה 1. הם הראו שהתכונות ספקטרליות של מתחמי LHC מחדש היו מאוד דומות למתחמים מטוהרים מצמחים. קלות מחדש של מתחמי פיגמנט חלבון LHC, סביר להניח בשל כמה תכונת הרכבה עצמית טבועה, יחד עם הקושי בבידוד מתחמים מטוהרים מאורגניזמים, הובילו לאימוץ מהיר של השיטה על ידי חוקרים אחרים. הכינון מחדש של חלבונים פוטוסינתטיים ביתר בEscherichia coli (E. coli) הושג על ידי פאולסן ועמיתים בשנת 1990 6. בתוך א &#39;coli, חלבוני קרום ביטוי יתר כלולים בדרך כלל בגופי הכללה, שמתקני הטיהור שלהם. הכינון מחדש מושגת באמצעות denaturation חום של גופי ההכללה המכילים חלבון רקומביננטי בנוכחות LDS, ואחריו התוספת של פיגמנטים היוזמת את קיפול החלבונים. קיפול של מתחם LHCII הוא תהליך בן שני שלבים: ראשון, כלורופיל כרוך בדקות פחות מ 1; שני, כלורופיל b מאוגדת והתייצבה מעל 7 מספר דקות. בנוסף לאספקת תובנה הדינמיקה מתקפל, בכינון מחדש חוץ גופית בשילוב עם מכוון mutagenesis אתר אפשר זיהוי של חומצות אמינו ספציפיות חשובות ליציבות (לדוגמא, 8,9) או תיאום פיגמנט (למשל, 10). גם מניפולציה של קיפול מחדש של תנאים על ידי התאמת פרמטרים כמו הרכב פיגמנט או בדטרגנטים זיהו critica אלמנטיםl לקיפול נכון, כגון הדרישה של Xanthophylls למורכב LHCII (למשל, 1,11). בנוסף, החקירה של התכונות של פיגמנטים בודדים קשורים למתחמים הייתה אפשרית באמצעות מתחמים מחדש in vivo (למשל, 10). השיטה המתוארת כאן מתחילה עם בידוד של פיגמנטים (chlorophylls וקרוטנואידים) מתרד וreinhardtii Chlamydomonas האצה הירוק. הביטוי וטיהור של חלבון LHC מE. coli בצורה של גופי הכללה לאחר מכן מפורט, ואחריו את הכינון מחדש של LHC וטיהור שלאחר מכן לפי עמודה זיקת Ni. בשלב האחרון, מתחמים מחדש הם מטוהרים עוד יותר על ידי צנטריפוגה שיפוע סוכרוז כדי להסיר פיגמנטים חופשיים וapoprotein פרש. פרוטוקול זה מייצג הליך מותאם בשילוב כמה שינויים שהוכנסו על ידי מעבדות שונות על פניזמן 1,6,10,12 -14.

<table><tbody><tr><td>HisTrap HP</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>בד ניילון&nbsp;</td><td></td><td></td><td>20 &mu; m נקבוביות</td></tr><tr><td>מכחול צבע של אמנים רכים&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NONIDET P-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Beta-DM</td><td>Sigma</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>DNAase</td><td>ThermoScientific</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>אבקות</td><td></td><td></td><td></td>חלב</tr><tr><td>RNAase</td><td>ThermoScientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>סוניקטור</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אוקטיל ובטא;- D-גלוקופירנוסיד</td><td>סיגמא</td><td>O8001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה XL</td><td>מדיום</td> בקמן-קולטר <td></td><td></td></tr><tr><td>TAP</td><td>ראה התייחסות 17</td>מדיום LB ראה התייחסות 19 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

במבחנת כינונה מחדש של מכלולי אור קציר של צמחים ואצות ירוקות

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

בצמחים ואצות ירוקות, אור הוא נתפס על ידי מתחמי אור הקציר (LHCs), משפחה של חלבוני קרום נפרד שירכזו chlorophylls וקרוטנואידים. בחי, חלבונים אלה מקופלים עם פיגמנטים ליצירת קומפלקסים אשר מוכנסים בקרום thylakoid של הכלורופלסט. הדמיון הגבוה בתכונות כימיות ופיסיות של בני המשפחה, יחד עם העובדה שהם יכולים בקלות לאבד את הפיגמנטים בבידוד, עושה הטיהור שלהם במדינה האם של מאתגרת. גישה חלופית כדי להשיג הכנות הומוגנית של LHCs פותחה על ידי Plumley ושמידט בשנת 1987 1, שהראה כי ניתן היה להקים מחדש מתחמים אלה במבחנה החל מפיגמנטים מטוהרים וapoproteins פרש, וכתוצאה מכך מתחמים עם מאפיינים מאוד דומים לזה של ילידים מתחמים. זה פתח את הדרך לשימוש בחלבוני רקומביננטי הביעו חיידקים במבחנה </eהכינון מחדש מ &#39;&gt;. שיטת הכינון מחדש היא חזקה מסיבות שונות: (1) ניתן להשיג הכנות טהורות של מתחמים בודדים, (2) הרכב פיגמנט יכול להיות מבוקר על מנת להעריך את תרומתם למבנה ותפקוד, (3) יכולים להיות מוטציה חלבונים רקומביננטי ללמוד פונקציונלי תפקיד של השאריות בודדות (לדוגמא, אתרי פיגמנט מחייב) או תחום חלבון (למשל, אינטראקציה בין חלבונים, קיפול). שיטה זו כבר מותאמת במספר מעבדות ומוחלת על רוב מתחמי אור הקציר. הפרוטוקול המתואר כאן מפרט את השיטה של הבנייה מחדש מתחמי אור קציר במבחנה המשמשים כיום במעבדה שלנו, ודוגמאות המתארות יישומים של השיטה מסופקות.

פרוטוקול זה מפרט את הבנייה מחדש של קומפלקסים לקצירת אור במבחנה. חלבוני הממברנה האינטגרליים הללו מתאמים כלורופיל וקרוטנואידים ואחראים לקצירת אור בצמחים גבוהים יותר ובאצות ירוקות.

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לשחזר in vitro קומפלקסים של חלבוני פיגמנט לקליטה של אור מצמחים או מאצות. דבר זה מושג על ידי מיצוי הפיגמנטים מעלי תרד או מתרביות של אצות, וביטוי יתר של חלבון ה-APA ב-e coli. כשלב שני, מערבבים את חלבון ה-APA עם הפיגמנטים כדי לקבל קומפלקס משוחזר.בשלב הבא, קומפלקס חלבון-פיגמנט השוחזר מטוהר מהפיגמנטים העודפים, ותוצאות החלבון הלא-מקופל (unfolded protein) מראות מאפיינים ספקטרוסקופיים דומים בין קומפלקס חלבון-פיגמנט השוחזר לבין הקומפלקס הטבעי, על בסיס ספקטרום בליעה, ספקטרום פלואורסצנציה ודיכרואיזם מעגלי. היתרון המרכזי של הליך זה הוא שהוא מאפשר להפיק כמות גבוהה יחסית של קומפלקסי חלבון-פיגמנט, וכן לבצע מניפולציות על הקומפלקסים באמצעות תערובות של חלבונים מוטסים ופיגמנטים בהרכבים שונים, מה שמוכיח כי ההליך יהיה יעיל. אלברטו, סטודנט לתואר שני במעבדה, יתחיל את הליך מיצוי הפיגמנט הכולל מעלי תרד. השתמש בבלנדר כדי להומוגניзировать חופן עלי תרד, כ-20 גרם, ב-100 milliliters של בופר טחינה קר למשך 20 שניות.סננו את התמיסה דרך שתי שכבות של בד ניילון בעל נקבוביות בקוטר של 20 micrometers וסבבו את התסננת בצנטריפוגה ב-1, 500 Gs למשך 10 דקות, בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. הסירו את הנוזל העליון והוסיפו מיליליטר אחד של בופר שטיפה קר.שחזר את המשקע המכיל את הכלורופלסטים באמצעות מכחול ציירים רך. לאחר שחזור המשקע, הוסף 50 milliliters של תמיסת שטיפה (wash buffer) וסבב במערך צנטריפוגה במהירות של 10,000 Gs למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. הסר את הנוזל העליון (supernatant) ושחזר בעדינות את המשקע ב-50 milliliters של תמיסת שטיפה; סבב במערך צנטריפוגה במהירות של 10,000 Gs למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, והסר לחלוטין את הנוזל העליון משלב זה ואילך.יש לבצע הליך זה בחושך. כדי למנוע חמצון של פיגמנטים, הוסף כ-20 milliliters של 80%acetone בבופר של נתרבן קרבונט (sodium carbonate) לצורך מיצוי הפיגמנטים, והשאר את התמיסה על קרח למשך 10 דקות. ערבב מדי פעם ב-Vortex, ולאחר מכן השקע את מרכיבי התא על ידי סנטריפוגה ב-12, 000 Gs למשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.מיצוי פיגמנטים מלא אמור להוביל לקבלת משקע לבן. העבירו את התוצר לנוזל להפרדה. הוסיפו 0.4 נפחים של dathyl ether.נערו בעוצמה וודאו שפתחתם את השסתומים כדי לשחרר את הגז. הוסיפו 0.8 נפח של sodium chloride בריכוז 0.33 M וערבבו בעוצמה. המתינו כ-10 דקות עד להפרדה של השכבות.פאזת האתר בחלק העליון מכילה את הפיגמנטים שהופקו. יש להסיר ולהשליך את הפאזה התחתונה השקופה. יש להוציא את האתר על ידי שפיכתו מהחלק העליון של משפך ההפרדה אל תוך כלי זכוכית מתאים.ייבשו את האתר על ידי הוספת כף של נתרן סולפיה אנहाइडרי גרנולרי. סובבו את התמיסה בעגולה והמתינו כחמש דקות כדי שהחומר מייבש יספוג את המים מהאתר. כאשר האתר מיובש מספיק.צריכים להיות גבישים ששוחים באופן חופשי ללא התגבשות של ה-sodium sulfate. העבר את האתר למכל זכוכית חדש, תוך השארת מוצקי ה-sodium sulfate מאחור; חלק את הפיגמנטים ליישומים (aliquots) וייבש אותם ב-rotary speed vac עד שהאצטון יתאדה לחלוטין. אחסן את הפיגמנטים המיובשים בטמפרטורה של 80- degrees Celsius.מיצוי הקרטינואידים מהתרד לא מוצג בסרטון זה, אך הפיגמנטים המיובשים מאוחסנים גם הם בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. קומפלקס קציר האור או ה-LHC לצורך הרכבה מחדש (reconstitution) בוטה וטוהר מ-e coli בצורת גופי הכללה (inclusion bodies). להצלחת ההרכבה מחדש, היחס בין חלבוני הפיגמנט לבין כמות הבאפר שנעשה בה שימוש הוא קריטי.יש לבצע הליך זה בתאורה עמומה. השהו מחדש 800 micrograms של גופי הכללה של LHC בנפח כולל של 400 microliters של te. לתוך מבחנת צנטריפוגה של שני מיליליטר, הוסיפו 400 microliters של reconstitution buffer בריכוז פי 2 וערבבו באמצעות vortex.הוסף בקצרה 0.6 µL של תמיסת סטוק של beta mar CAPTA ethanol בריכוז 14.8 M. כדי להגיע לריכוז סופי של 10 mM, חמם את החלבון בטמפרטורה של 98 °C למשך דקה אחת. ערבב קצרות ב-Vortex והשאר בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות.שחזר 500 micrograms של פיגמנטים ಒובליים של כלורופיל מיובשים, בתוספת 80 micrograms של פיגמנטים קרטנואידים, ב-30 microliters של 100% ethanol באמצעות ערבול נמרץ ב-vortex למשך דקה אחת. סבב את תערובת הפיגמנטים ב-15,800 Gs בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius למשך כ-30 שניות, וודא שלא נוצר משקע מיד לאחר הסבב, והוסף את תערובת הפיגמנטים באיטיות לחלבון המקורר תוך כדי ערבול ב-vortex.היזהרו לא לבצע ערבוב ב-vortex בעוצמה רבה מדי, שכן החלבון עלול לגלוש מחלקו העליון של המבחנה. המשיכו בערבוב ב-vortex למשך 5 עד 10 שניות ולאחר מכן הניחו את המבחנה על קרח רטוב. הוסיפו 94 µL של 20% octal, beta D glucocide, או og כדי להגיע לריכוז סופי של 2%. ערבבו קצרות ב-vortex והשאירו על קרח למשך 10 דקות, ולאחר מכן הוסיפו 90 µL של potassium chloride בריכוז 2 M כדי להגיע לריכוז סופי של 150 עד 200 µM.ערבבו בקצרה במערבל וורטקס ושמרו על קרח למשך 20 דקות. סבבו בנצירה במהירות של 15,800 GS בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. העבירו את ה-SUP natant למבחנה של 10 מיליליטר מבלי להפריע למשקע.יש לשמור את ה-natin בקירור ומוגן מאור. התחילו את הפרוצדורה בהכנת עמודת nickel SROs של מיליליטר אחד כפי שמתואר בטקסט של הפרוטוקול. הוסיפו שלושה עד ארבעה מיליליטרים של OG buffer לדגימת החלבון וטענו את הדגימה על העמודה.שטפו את העמודה בחמישה מיליליטרים של OG buffer, ולאחר מכן בשני מיליליטרים של OG rinse buffer. אלוטו את החלבון הקשור באמצעות שלושה מיליליטרים של elu buffer. אספו את ה-ellu הירוק המכיל את החלבון המשוחזר.את מדרג הסוכרוז מכינים כפי שמתואר בטקסט של הפרוטוקול; מסירים בזהירות מהחלק העליון של המדרג נפח זהה לזה של הפракציה הירוקה שהוזכרה מעמודת ה-nickel SROs. טוענים באיטיות את הדגימה המשוחזרת לחלק העליון, תוך הקפדה לא להפר את המדרג. מניחים את המבחנה ואת האיזון בתוך רוטור עם דליים מתנדנדים מסוג S SW 41 או SW 60 ומסובבים באולטרה-צנטריפוגה ב-200,000 Gs בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 18 שעות, עם האצה ועצירה איטיות וללא בלימות.עם סיום פעולת האולטרסנטריפוגה, השתמש בפינצטה כדי להוציא בזהירות את המעבר (gradient) מתוך מחזיק המבחנה. הפס הירוק הוא פרקציה שיש לאסוף. ספקטרום הבליעה של CP 24.חלבון קושר כלורופיל AB שהורכב מחדש in vitro מושווה לספקטרום של הקומפלקס הטבעי. הספקטרומים הזהים מעידים על הרכב וארגון פיגמנטים זהים למעשה. ניתן להעריך את איכות הקומפלקס שהורכב מחדש גם באמצעות ספקטרוסקופיית פלואורסצנציה.מאחר שהפיגמנטים פולטים פלואורסצנציה בעת עירור באורכי גל שונים, כלורופיל A פולט ב-440 nanometers, כלורופיל B ב-475 nanometers וזילילס (zils) ב-500 nanometers. ספקטרומי פליטת הפלואורסצנציה של קומפלקס CP 24 wildtype שחובח, אשר נורמלו למקסימום, מראים העברת אנרגיה יעילה מכלורופיל B ומקסנתיפילים (XANTHE fills) לכלורופיל A. ניתן לזהות נוכחות של כלורופיל B שאינו מתואם לחלבון על ידי כתף נוספת סביב 650 nanometers. נוכחות של כלורופיל A חופשי מובילה לעומתה לפליטה נוספת סביב 675 nanometers.ספקטרומי הפליטה הפלואורסצנטיים ב-475 nanometers של קומפלקס ה-CP 24 המשוחזר והטבעי מראים שיא בודד ב-681 nanometers, המצביע על כך שהקומפלקס המשוחזר מקופל בצורה נכונה. CP 24 משוחזר והקומפלקס הטבעי מראים גם ספקטרומי דיכרואיזם מעגלי דומים מאוד. ניתן לשנות שאריות של חומצות אמינו בודדות החשובות לקואורדינציה של פיגמנטים שונים כדי לנתח את התכונות של פיגמנטים בודדים או להעריך את תרומתם לתפקוד וליציבות של הקומפלקס.מוצגים כאן ספקטרומי הבליעה של CP 29 מסוג בר ושל CP 29 מוטציה. הקו הירוק מראה את ההבדלים בין שני הגרפים. כאשר טכניקה זו, הכוללת גרדיאנט SUSE ואולטרה-צנטריפוגציה, מבוצעת כראוי, היא עשויה להיסתיים תוך 24 שעות.

in-vitro-reconstitution-light-harvesting-complexes-plants-green

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הגישה המתוארת ההשוואתית, כמותית proteomic מטרתה קבלת תובנות לתוך הרכב של מתחמי multiprotein בתנאים שונים ומודגמת על ידי השוואת זנים שונים מבחינה גנטית. ניתוח כמותי כמויות שווה של שברים שונים מצפיפות סוכרוז שיפוע מעורבבות ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה.

גישה חדשה לניתוח השוואתי של multiprotein מכלולים בהתבסס על<sup&gt; 15</sup&gt; N מטבולית תיוג וכמותי ספקטרומטריית המסה

כתב יד זה מתאר שיטה פשוטה תפוקה גבוהה להרכבת חלבונים מסיסים במים עם פיגמנטים הידרופובי אשר מבוססים על אמולסיות מים-in-שמן. אנו מדגימים את היעילות של השיטה באסיפה של כלורופיל ילידים עם ארבע וריאציות של מסיס-מים כלורופיל רקומביננטי מחייבים חלבונים (WSCPs) של צמחי Brassica לידי ביטוי E. coli.

המים אמולסיות שמן: מערכת חדשה להרכבת חלבונים מסיסים במים כלורופיל מחייב עם פיגמנטים הידרופובי

כאן אנו מתארים הליך לחקר רקמות צמחים שבורות בהקפאה. דגימות עלים קפואות בלחץ גבוה שבורות בהקפאה ומצופות בשכבה כפולה, ומניבות דגימות קפואות-לחות שמורות היטב המצולמות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק בהגדלות גבוהות עם נזק מינימלי לאלומה.

לימוד ההסתדרות המולקולרית של פוטוסינתזה ממברנות בתוך הרקמות ליף Freeze-שבר ידי Cryo-סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד fucoxanthin כלורופיל a/c מחייב חלבונים (FCP) מ- diatoms ועד לשלב אותם בתוך ליפוזומים עם יצירות השומנים טבעית ללמוד עירור העברת אנרגיה על שינויים בהרכב יון.

בידוד, שילוב אנטנות קציר-אור של צורניות Cyclotella Meneghiniana בתוך ליפוזומים עם שומנים תילקואיד

פרוטוקול עבור הבהרה של הצמח תילקואיד חלבון הארגון מורכבים ו הלחנה אצל כחול לזיהוי יליד ג'ל אלקטרופורזה (בסון-עמוד) ותיאר 2D-מרחביות עמודים. הפרוטוקול ממוטבת עבורו תודרנית לבנה, , אבל ניתן להשתמש עבור שאר מיני צמחים עם שינויים מזעריים.

ניתוח של מתחמי חלבון ממברנה תילקואיד מאת כחול מקורי אלקטרופורזה בג'ל

אנו מציגים פרוטוקולים בזאת לבידוד לתפוקה גבוהה של פעיל מבחינה פיזיולוגית thylakoids, חלבון מבחני תחבורה עבור רוברטסונית ארגינין טווין כלורופלסט (cpTat), הפרשה (cpSec1), אות זיהוי החלקיקים (cpSRP) מסלולים.

בידוד של פעיל מבחינה פיזיולוגית Thylakoids, השימוש בהם במסגרת מבחני תחבורה אנרגיה תלוית חלבון

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להפריד בין מתחמי תילקואיד solubilized על ידי הילידים בג'ל ירוק. להקות ג'ל ירוק לאחר מכן מאופיינים על ידי הזמן בקורלציה יחיד פוטון לספור (TCSPC) ומסופקים שלבים בסיסיים לניתוח נתונים.

ההפרדה של תרד תילקואיד חלבון מתחמי מאת מקורית ירוק בג'ל ואפיון הלהקה באמצעות Time-Correlated סופר פוטון יחיד

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הדמיה אוטופלואורסצנטית שלב אחר שלב והערכה של שינויים בחלבון פיקובילין באצות אדומות בהתבסס על אנליזה ספקטרלית. זוהי שיטה נטולת תוויות ולא הרסנית להערכת הסתגלות התאית לבתי גידול קיצוניים, כאשר רק חומר נדיר זמין ותאים גדלים לאט, או בכלל לא, בתנאי מעבדה.

הדמיה אוטופלואורסצנטית להערכת פיזיולוגיה של אצות אדומות

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בטרנספורמציה בתיווך גידולים אגרובקטריום (AMT) לשילוב גנים בעלי עניין בגנום הגרעיני של המיקרו-אצות הירוקות Chlorella vulgaris, מה שמוביל לייצור טרנספורמנטים יציבים.

Agrobacterium tumefaciens-מתווך גנטי של מיקרו-אצות ירוקות, Chlorella vulgaris

מיקרוסקופיה מולקולה בודדת approch סיפק תובנות הרומן לתוך התחבורה גרעיני.

מולקולה בודדת הדמיה התחבורה גרעיני

למד כיצד לכונן מחדש מכלולי אור קציר של צמחים ואצות ירוקות במבחנה. השיטה כוללת חילוץ פיגמנטים מעלי תרד וביטוי חלבון APA ב-E. coli לניתוח ספקטרוסקופי.

במבחנת כינונה מחדש של מכלולי אור קציר של צמחים ואצות ירוקות

גלה סרטונים נוספים