Primer Hücre Kültürü Araştırmaları Chick retina Verimli Gen Transferi: Bir Eski-ovo Elektroporasyon Yaklaşımı

Bu prosedürün genel amacı, primer retina kültürlerinde fonksiyonel genetik çalışmaları mümkün kılmak için retina hücrelerinin yüksek verimlilik, plazmid, transfeksiyonunu elde etmektir. Bu, ilk olarak hamburger ve Hamilton sisteminin 27. aşamasında tavuk embriyolarının toplanmasıyla gerçekleştirilir. Optimum verimlilik elde etmek için uygun evreleme kritik öneme sahiptir.

İkinci adım, embriyonik gözleri incelemek ve nöral retinayı açığa çıkaran retina pigmentli epitelin çıkarılmasıdır. Daha sonra, retina kabı plazmit çözeltisi ile dolu bir odaya yerleştirilir. Daha sonra, kolayca inşa edilmiş özel yapım elektrotlar kullanılarak optimize edilmiş koşullar altında elektroporasyona tabi tutulur.

Son adımlar, vitreus gövdesini ve lensi çıkarmak ve düşük yoğunluklu primer kültür için nöral retinayı tek hücrelere ayırmaktır. Sonuç olarak, transfekte edilmiş hücreler, raportör genlerin ekspresyonu veya immünohistokimya ile görselleştirilebilir ve etkili genetik manipülasyon, aşağı akış genlerinin ekspresyonu ve/veya fenotipik hücre değişiklikleri değerlendirilerek değerlendirilebilir. Bu tekniğin lipofeksiyon veya kimyasal transfeksiyon gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, retina hücrelerinin transfeksiyon oranını beş kat arttırması ve toplam hücre popülasyonunun% 22 ila 25'i arasında verimlilik sağlamasıdır.

Bu yöntem, fotoreseptör biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, çünkü birincil retina kültürlerinde gen ekspresyonunun biyolojik olarak anlamlı içgörüler sağlayabilecek bir verimlilik düzeyinde manipüle edilmesine izin verir. Bu tekniğin etkileri, ilaç geliştirme için yüksek verimli teknolojilere kolayca uyarlanabildikleri için temel araştırmanın ötesine uzanır. Döllenmiş beyaz bacak boynuzlu tavuk yumurtalarını bir yumurta kuluçka makinesinde beş gün boyunca 37,5 santigrat derecede ve% 60 bağıl nemde kuluçkaya yatırarak başlayın.

Deneyden önce, normalde mikro pipet çekmelerinde kullanılan bir kutu filamenti edinin. Kare kutuyu geri almak için forseps kullanın ve filamenti uzun bir şerit halinde düzeltin. Daha sonra bir cetveli kılavuz olarak kullanarak, filamenti tabanda üç milimetre uzunluğunda ve diğer tarafla bir tarafta iki milimetre yüksekliğinde kare u şeklinde bükün, filamentin kalan uzunluğu elektrotu% 96 etanole batırmak için forseps kullanın ve sterilize etmek için elektrotu kısaca alevlendirin.

Ardından, elektrotun uzun koluna küçük bir timsah klipsi olan bir elektrik kablosu takın. Ardından, kalın altın uçlu elektrodu %70 etanol kullanarak temizleyin. Ardından, sterilize edilmiş bir makas kullanarak steril 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünün kapağını keserek ve düz tarafı aşağı bakacak şekilde bant kullanarak 100 milimetrelik bir Petri kabına yapıştırarak elektroporasyon odasını hazırlayın.

Ardından, alet uçlarını %96 etanole batırarak ve kısa bir süre ateşleyerek mikrodiseksiyon aletlerini sterilize edin. Ayrıca, diseksiyon kapsamını %70 etanol kullanarak silerek temizleyin. Bir şişe steril kalsiyum ve magnezyum içermeyen Hanks denge tuzu çözeltisini 37 derece santigrat su banyosunda ısıtın.

Isındıktan sonra, 100 milimetrelik steril bir Petri kabının dörtte üçünü doldurmak için kullanın. Daha sonra elektroporasyon odasını temiz bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Daha sonra elektrotları elektroporasyon aparatına bağlayın, özel yapım elektrotun negatif kutba bağlı olduğundan ve altın uçlu elektrotun makinenin pozitif kutbuna bağlı olduğundan emin olun.

Kabukların dışını %70 etanol ile silerek yumurtaları temizleyin. Dikkatli olun ve protokolün geri kalanı boyunca steriliteyi koruyun. Büyük kavisli Maloney forsepsleri kullanarak kültürlere kontaminasyon taşımaktan kaçınmak için, bir yumurtanın yuvarlak ucuna doğrudan hava odasının üzerine hafifçe vurarak yumurta kabuğunda dikkatlice bir delik açın.

Tüm kabuk parçalarını başka bir forseps ile dışarı çekin. Zarları çıkarın ve embriyoyu yumurtadan dikkatlice çıkararak toplayın. Embriyoyu önceden ısıtılmış kalsiyum ve magnezyum içermeyen Hanks Balance tuz çözeltisi ile bir Petri kabına yerleştirin.

Uygun sayıda embriyo toplandığında, hepsinin doğru aşamada olduğundan emin olun. Hamburger ve Hamilton evreleme sistemine göre optimum verim için embriyoların 27. evrede olması gerekmektedir. Maloney forseps kullanarak dekapitasyon yoluyla embriyoları ötenazi yapın ve ardından gözleri dikkatlice ve çekirdeklerini çıkarmak için dumont cımbız kullanın.

Gözleri kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS içeren yeni bir Petri kabına aktarın. Optik sinir kafasına yakın her bir gözün arka kısmından başlayın ve ardından nöral retina ile retina pigmentli epitel arasına her bir dumont cımbız çiftinin bir ucunu sokun. Gözün arka kısmından öne doğru çalışarak, retina pigmentli epiteli dikkatlice incelemek için cımbız kullanın.

Nöral retinaya zarar vermemek için dikkatli olmak. Elektro perteri, 50 milisaniye süre ve 950 milisaniye aralıklarla 15 voltluk beş kare darbe verecek şekilde ayarlayın. Daha sonra, elektroporasyon odasını PBS'de mikrolitre başına 1.5 mikrogram konsantrasyonda 120 mikrolitre plazmit çözeltisi ile doldurun.

Ardından U şeklindeki negatif elektrodu mikro santrifüj kapağı elektroporasyon odasına yerleştirin. Bir çift kavisli dumont cımbız kullanarak. Bir retina kabını elektroporasyon odasına aktarın ve U şeklindeki elektrotun içine yerleştirin.

Retinayı, arka kısmı elektrotun altına doğru ve lens yukarı bakacak şekilde konumlandırın. Ardından, anodu merceğin yanındaki gözün ön kısmına değecek şekilde yerleştirin. Ardından, beş elektrik darbesi vermek için elektro akıncının ayak pedalını kullanın.

Bittiğinde, elektroporasyonlu retina kabını kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS ile doldurulmuş yeni bir Petri kabına aktarın. Elektroporasyon prosedürünü her ek retina kabı ile tekrarlayın. Transfeksiyon verimliliğinde önemli bir azalma olmaksızın aynı plazmit çözeltisi ile altı adede kadar retina kabı elektroporasyon yapılabilir.

Daha sonra, çıkarıldıktan sonra kavisli dumont cımbızının arkası ile gözü yerinde tutarken, her elektroporasyonlu numuneden lensi ve vitreus gövdesini nazikçe çıkarmak için bağ dişli forseps kullanın, standart teknikler kullanarak elektroporasyonlu retina hücrelerinin ayrışmasına ve kültürüne devam edin. Burada gösterilen retina hücreleri, bir GFP ekspresyonu, plazmid ile elektropore edildi, ayrıştı ve dört gün boyunca kültürlendi. Floresan mikrograflar, zarif leke çekirdekleri ve retina hücrelerini ifade eden GFP'yi gösterdi.

Fotoreseptör hücreleri tanımlamak için anti visin antikor boyaması yapıldı. Bu protokolde açıklanan parametreler, dört gün sonra toplam popülasyonla karşılaştırıldığında ortalama %22'lik transfect verimlilikleri elde etmek için optimize edilmiştir. Kültürde, bu önlem ortalama %25'e çıkar verimlilik, yalnızca fotoreseptör popülasyonu kabul edildiğinde Bir kez ustalaştıktan sonra kabul edilir.

Embriyo toplamadan elektro operasyona kadar olan bu teknik, uygun şekilde uygulandığı takdirde altı göz için 30 dakikadan daha kısa bir sürede yapılabilmektedir. Bu prosedürü denerken, iyi kalitede bir kültür elde etmek için embriyoların toplanması ile ayrışmış hücre kaplaması arasında üç saatten fazla geçmemesi gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu teknik, örneğin bir RNAi sistemi kullanılarak gen aşırı ekspresyonu veya korelasyonu için uygulanabilir.

Ek olarak, bu işlemi takiben transfekte edilen retinalar organotipik retina kültürleri için kullanılabilir.