L'impianto di fibrina gel sul mouse polmone per studiare angiogenesi Lung-specifica

L'obiettivo generale della seguente procedura è utilizzare l'impianto di gel di fibrina per studiare la rigenerazione vascolare e alveolare nel polmone del topo. Ciò si ottiene preparando prima gocce di gel di fibrina, integrate con fattori angiogenici. Nella seconda fase, l'animale da esperimento viene ventilato meccanicamente e il torace viene aperto.

Successivamente, un gel di fibrina viene accuratamente attaccato al polmone del topo con colla di fibrina. E poi, nella fase finale, il polmone e il gel impiantato vengono raccolti da sette a 30 giorni dopo per l'analisi istologica. In definitiva, la formazione dei vasi sanguigni e delle alveolari all'interno dell'impianto di gel può essere valutata mediante analisi immunoistochimica.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia vascolare, come ad esempio come gli organi rischiano il microambiente, controllano l'angiogenesi e la morfogenesi degli organi, dimostrando che la procedura sarà un modello bema un collega del nostro laboratorio Per preparare gel di fibrina che contengono sia VEGF che BFGF iniziare riscaldando meno 80 gradi Celsius, scorte di fibrinogeno e trombina a temperatura ambiente. Quando le scorte sono completamente scongelate, aggiungere trombina, cloruro di calcio, VEGF e BFGF alla soluzione di fibrinogeno in una provetta da 1,5 millilitri. E poi mescolare la soluzione mediante pipettaggio.

Quindi pipettare delicatamente 200 microlitri di miscela, goccia a goccia su un piatto di plastica sterile. Incubare le gocce a 37 gradi Celsius per 30-60 minuti fino a quando non si solidificano. Quindi usa piccole forbici chirurgiche per tagliare i gel in cubi di circa tre per tre per tre millimetri.

Dopo aver confermato la sedazione completa in un topo di età compresa tra otto e 12 settimane con un pizzico per le dita dei piedi, coprire gli occhi dell'animale con un unguento veterinario per prevenire la secchezza, quindi radere il pelo sul lato sinistro della gabbia toracica. Per l'intubazione endotracheale, posizionare il mouse su un supporto per intubazione inclinato a 70 gradi e agganciare gli incisivi superiori su un piccolo elastico situato nella parte superiore del supporto per tenere l'animale in posizione. Usa una pinza smussata per ritrarre delicatamente la lingua da un lato, quindi visualizza la laringe con l'aiuto di un illuminatore per microscopio a collo d'oca a fibra ottica.

Quindi, inserire un catetere elastico endotracheale calibro 21 nella trachea. Verificare che il topo respiri spontaneamente senza intoppi, quindi posizionare l'animale in posizione prona sotto il microscopio di dissezione. Utilizzare un ventilatore per roditori per ventilare meccanicamente l'animale a 150 respiri al minuto e sette millilitri per chilogrammo di volume corrente.

E poi contare le costole per individuare lo spazio intercostale tra la quarta e la quinta costola. Quindi pulire accuratamente l'area con alcol e iodio povidone per creare un campo sterile e coprire l'area chirurgica con un tra sterile per posizionare il gel sul polmone. Successivamente, praticare un'incisione cutanea trasversale di un centimetro sullo spazio intercostale.

E poi fai un'incisione muscolare tra la quarta e la quinta costola. Inserire un divaricatore da dissezione tra le costole per visualizzare completamente il polmone sinistro, quindi utilizzare una pinza fine per raschiare un quadrato di pleura viscerale di un millimetro per un dal centro del polmone sinistro utilizzando un batuffolo di cotone sterile. Quindi, applicare una leggera pressione sull'area fino a quando l'emorragia e le perdite d'aria non sono completamente controllate, quindi erogare una piccola quantità di colla di trombina fibrinogeno non solidificata sull'area.

Quindi, posizionare delicatamente un gel di fibrina sulla colla e osservare i movimenti respiratori del polmone per determinare che il gel sia ben fissato. Quindi chiudere le incisioni con una sutura riassorbibile. Aspirare la cavità toracica con una siringa da un millilitro dotata di ago calibro 27 per prevenire lo pneumotorace, quindi terminare la ventilazione meccanica.

Dopo aver confermato che il topo respira senza intoppi, iniettare un millilitro di cloruro di sodio allo 0,9% prebellico per via intraperitoneale per prevenire la disidratazione e consentire al topo di riprendersi su un cuscinetto di acqua calda circolante. Una volta che l'animale mostra una respirazione stabile, rimuovere il tubo endotracheale e iniettare un analgesico postoperatorio. Quando l'animale si è completamente ripreso, rimettilo in una nuova gabbia isolata dai topi senza intervento chirurgico, monitorando quotidianamente l'animale per segni di infezione o complicanze.

Da sette a 30 giorni dopo l'impianto, sopprimere il topo secondo il protocollo e praticare un'incisione tra la punta del processo xifoideo e la tacca sternale. E poi tagliare la trachea sezionando tutte le connessioni dal polmone al cuore e alla trachea, raccogliere l'intero polmone e il gel impiantato, quindi fissare il gel e il tessuto polmonare all'interno di una soluzione di aldeide paraforme al 4% durante la notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo, incorporare il tessuto polmonare nel composto OCT e quindi raccogliere sezioni seriali del polmone e del gel a uno spessore di 30 micrometri. Colorare le sezioni con ematina ed eoina e anticorpi contro i marcatori di interesse appropriati.

E poi, dopo aver scattato le immagini delle sezioni di Zack, compila le pile delle sezioni ottiche per formare immagini tridimensionali delle cellule endoteliali ed epiteliali del polmone. Utilizzo di un software di analisi delle immagini 3D. Infine, quantificare le aree proiettate dei vasi sanguigni appena formati utilizzando l'apposito software di analisi delle immagini.

Sette giorni dopo l'impianto, il gel di fibrina viene incorporato nel polmone ospite La ricostruzione 3D delle immagini a fluorescenza confocale ha dimostrato che le cellule endoteliali CD31 positive derivate dall'ospite formano reti vascolari all'interno dei gel sette giorni dopo l'impianto in modo dipendente dalla dose A-V-E-G-G-F-F, le cellule epiteliali polmonari positive all'acquaporina di tipo uno, cinque positive all'acquaporina e la proteina B positiva al tensioattivo di tipo due vengono reclutate anche lungo i vasi sanguigni appena formati all'interno dei gel che vengono integrati con concentrazioni più elevate di VGF e B, FGFH e d. La colorazione delle sezioni istologiche rivela che anche altri tipi di cellule ospiti migrano nel gel sette giorni dopo l'impianto. Questi risultati suggeriscono che le reti vascolari rigenerative derivate dal polmone ospite e la formazione alveolare sono costruite con successo all'interno dei gel di fibrina dopo l'integrazione con fattori angiogenici e l'impianto sulla superficie del polmone di topo adulto dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada a un minor numero di ricercatori nel campo della biologia polmonare e della medicina primaria per esplorare il meccanismo della normale angiogenesi e come si manifesta nello stato di malattia nei polmoni di topo.