الكشف عن في الموقع مجمعات البروتين البروتين في ذبابة الفاكهة اليرقية الموصل العصبي العضلي عن طريق القرب ربط الفحص

الهدف العام من التجربة التالية هو الكشف عن التوطين الخلوي لتفاعلات بروتين البروتين الداخلي في ذبابة الفاكهة يرقة NMJ. يتم تحقيق ذلك من خلال إجراء التألق المناعي باستخدام زوج من الأجسام المضادة الثانوية المترافقة قليلة النوكليوتيدات تسمى مجسات PLA ، والتي ترتبط بالأجسام المضادة الأولية ضد البروتينين المعنيين. بعد ذلك ، يتم سد الفجوة بين مجسات PLA من خلال تهجين قليل النوكليوتيدات الموصلة.

فقط عندما يكون البروتينان على مقربة من بعضهما البعض ويتم تشكيل جزيء DNA دائري مغلق في الموقع ، ثم يتم إجراء تضخيم دائرة التدحرج في الموقع من أجل تضخيم التسلسلات داخل جزيء الحمض النووي الدائري المغلق ، والذي يتم اكتشافه لاحقا باستخدام قليل النوكليوتيدات التكميلية الموسومة بالفلورسنت. وبالتالي فإن إشارة الفلورسنت الناتجة الناتجة عن كل منتج تضخيم يمكن رؤيتها بسهولة كنقطة مضيئة مميزة عند عرضها باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الأخرى الموجودة مثل E اثنين من هطول الأمطار والتهديد ، هي أن جيش التحرير الشعبى الصينى قادر على اكتشاف التوطين الخلوي للبروتينات الداخلية داخل الأنسجة التي يتم توطينها على مقربة من بعضها البعض ومن المحتمل أن تشكل مركبا.

على الرغم من أن هذه الطريقة توفر نظرة ثاقبة لشبكات تفاعل البروتين والبروتين التي تحدث على وجه التحديد في de larva و mj. يمكن أيضا تطبيقه على أنظمة جولو الأخرى أيضا. اقترح الأنسجة الظهارية في الأجنة والأقراص الخيالية.

وسيتم توضيح الإجراء هيل، يو وها كينج، وهما فنيان من مختبرنا. بعد احتضان مزارع ذبابة الفاكهة عند 25 درجة مئوية لمدة خمسة إلى ستة أيام ، استخدم ملقطا دقيقا لالتقاط يرقات الطور الثالث الزاحفة من القوارير أو الزجاجات لغسل اليرقات. انقلها إلى طبق بتري صغير يحتوي على PBS.

ثم ضع إحدى اليرقات المغسولة في قرص السيجار S واغمرها في عدة قطرات من PBS المثلج البارد لإيقاقها ، مما يسهل التلاعب بها. ضع اليرقات بحيث يكون جانبها الظهري متجها لأعلى بحيث يكون مسارين القصبة الهوائية مرئيين تحت مجهر تشريح. ثم باستخدام الملقط للإمساك بدبوس منوشين ، قم بتثبيت اليرقات لأسفل في الطرف الخلفي بالقرب من اللوالب باستخدام دبوس آخر يخترق البشرة في الطرف الأمامي بالقرب من خطافات الفم ويمتد اليرقات برفق بالطول قبل تثبيتها لأسفل.

بعد ذلك ، باستخدام التشريح الدقيق ، قم بقرص الطرف الخلفي بالقرب من الدبوس لإنشاء فتحة صغيرة ، يجب أن يكون الشق سطحيا بما يكفي لتمريره عبر بشرة. ثم ضع طرف الشفرة السفلية للمقص في الشق ، وأثناء توجيه شفرات المقص لأعلى قليلا لتجنب إتلاف العضلات الأساسية ، قم بقص كامل طول خط الوسط الظهري بين المسالكين الرغامي. الآن قم بعمل شق أفقي صغير فقط من خلال بشرة ، أمام الدبوس الخلفي قليلا.

ثم قم بعمل شق آخر مماثل خلف الدبوس الأمامي قليلا. بعد إضافة بضع قطرات قوية من PBS إلى جسم اليرقات ، استخدم الملقط لتنظيف الأعضاء الداخلية بعناية. تجنب وخز جسم اليرقات لأن ذلك سيسبب ضررا للجسم.

تفتح عضلات الجدار جسم اليرقات وتثبيتها لأسفل ، وتمتد جدار الجسم أفقيا وعموديا لتشكيل مستطيل متوتر بشكل متساو. الحرص على عدم تمزق عضلات جدار الجسم في عملية إصلاح الأنسجة. اغمر جدران الجسم المثبتة في عدة قطرات من محلول البوسنة واحتضن على الجليد لمدة 15 دقيقة بعد التثبيت.

استخدم PBT لشطف المنديل ثلاث مرات. ثم لتوفير الكواشف والتأكد من معاملة جميع جدران الجسم بالتساوي أثناء الفحص. قص زوايا كل نمط جيني بشكل مختلف لتمييزها.

وبعد إزالة المسامير بالملقط الدقيق ، ضعها جميعا في نفس أنبوب الطرد المركزي الصغير المصنوع من السيليكون سعة 0.65 مل. لاختراق الأنسجة ، استخدم PBT لغسل جدران الجسم ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها. بعد إزالة الغسيل النهائي ، أضف 1٪ BSA لحجب العينات واحتضانها لمدة ساعة واحدة.

بجانب البقع المناعية ، تضيف جدران الجسم أجساما مضادة أولية للفئران والأرانب ضد البروتينين المعنيين وتحتضن لمدة ساعتين. في هذه الحالة ، يتم استخدام واحد إلى 10 ماوس مضاد ل DLG وواحد إلى 250 أرنب مضاد ل HTS في 1٪ BSA. يمكن أيضا إضافة الأجسام المضادة ضد العلامات بعد الحضانة.

استخدم PBT لغسل جدران الجسم ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منهما. ثم أضف الأجسام المضادة الثانوية المصنفة بالفلورو الأربعة ضد أي علامات في 1٪ BSA ، واحتضن في الظلام عند أربع درجات مئوية طوال الليل في صباح اليوم التالي. استخدم PBT لغسل جدران الجسم ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منهما.

لبدء الفحص عند التخفيف من واحد إلى خمسة في 200 ميكرولتر على الأقل. الحجم الإجمالي لكل من مسبار جيش التحرير الشعبى الصينى ، ومكافحة الفأر ناقص ومسبار جيش التحرير الشعبى الصينى المضاد للأرانب بالإضافة إلى 1٪ BSA لجدران الجسم تحتضن لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية بعد استخدام عازلة الغسيل A لغسل جدران الجسم مرتين لمدة خمس دقائق لكل منهما بتخفيف واحد إلى 40 من Ligase في محلول Ligase ، احتضان لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية بعد الحضانة. استخدم محلول الغسيل A لغسل جدران الجسم مرتين لمدة دقيقتين لكل منهما قبل إضافة مخفف من البوليميراز بمقدار واحد إلى 80 في محلول التضخيم.

احتضان لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية لتحضير العينات للتصوير. استخدم عازلة الغسيل B لغسل جدران الجسم مرتين لمدة 10 دقائق لكل منهما. ثم استخدم مخففا 100 × من المخزن المؤقت للغسيل B للقيام بغسيل نهائي لمدة دقيقة واحدة.

بموازنة جدران الجسم في بضع قطرات من محلول التثبيت لمدة 30 دقيقة على الأقل باستخدام ملقط ناعم. انقل جدران الجسم بعناية إلى شريحة منصة مع تباعد بشرتها لأسفل. ضعها في صفوف في نفس الاتجاه داخل قطرة أو اثنتين من محلول التركيب.

ضع غطاء مقاس 22 ملم × 40 ملم فوق المستحضر ، مع الحرص على عدم توليد فقاعات هواء. ثم استخدم طلاء أظافر شفاف لإغلاق الشريحة. قم بتخزين الشرائح على درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للتصوير متحد البؤر.

كما هو موضح هنا في اليرقات من النوع البري njs ، يوجد DLG في الغالب في الغشاء التالي المشبكي للبوتون الغلوتاماتيرجيك من النوع الأول مع مستويات أكثر وضوحا في النوع الأول B من النوع الأول S bs HTS الموجود في جميع أنحاء العضلات ، ولكنه يتركز في غشاء ما بعد المشبكي مع مستويات متساوية في كلا النوعين من بوتون ، يتداخل DLG و HTS إلى حد كبير في منطقة ما بعد المشبكي لتحديد ما إذا كان DLG و HTS موجودين في مجمع. في N-M-J-P-L-A تم إجراؤه باستخدام الأجسام المضادة المضادة ل DLG ومكافحة HTS كما هو موضح هنا. لوحظت إشارة PLA بين البروتينين على وجه التحديد في النوع البري NMJ ، حيث يتم توطين الإشارة في الغالب محيطيا إلى الغشاء قبل المشبكي المميز ب HRP.

وبالتالي ، فإن DLG و HTS على مقربة من المحتمل أن يشكلان مركبا في منطقة ما بعد التشابك. والنتيجة محددة كتحكم سلبي يتضمن طفرات HTS التي تفتقر إليها. لا تظهر HTS Immunoreactivity أي إشارة PLA يمكن ملاحظتها تظهر مشاهد التكبير العالية ل bns أن DLG و HTS Immunoreactivity يتداخلان بشكل كبير في الغشاء التالي للتشابك.

في المقابل ، ينتج عن PLA بين البروتينين PUNCTA منفصل يشير إلى أن مجموعة فرعية فقط من إجمالي بروتينات DLG و HTS معقدة بمجرد إتقانها. لا تستغرق هذه التقنية أكثر من إجراء كيميائي مناعي قياسي لإكمالها. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام PLA للكشف عن التوطين الخلوي لتفاعل بروتين البروتين الداخلي الذي يحدث في اليرقة NMJ.