December 4th, 2014
由于肥胖等合并症之间的激烈负极连接,对脂肪的作用发挥的研究在疾病和整体健康是必要的。我们提出了一个协议,用于分离和脂肪仓库允许利用原位脂肪研究的切除和体外方法。
该程序的总体目标是证明脂肪沉积的识别和切除,以分析脂肪对脂肪的不同因素影响。这是通过首先暴露成年小鼠的内部器官和脂肪库来实现的。在第二步中,去除器官和多余的组织以更好地暴露仓库,从而识别相应位置的仓库。
在最后一步中,然后特别小心地提取脂肪组织,以避免污染。最终,这些沉积物的分离和切除为组织学分析、蛋白质表达、酶活性和基因表达分析以及体外研究提供了组织。与现有方法相比,这种特定方案的主要优点是它允许以最少的解剖和最小的污染进行多个仓库隔离。
因此,该程序可以帮助回答有关肥胖领域的问题。例如,脂肪组织对人类疾病的有害甚至有益影响。要分离棕色脂肪组织,首先将乙醇、清洁、安乐死的成年小鼠置于仰卧位,背靠桌子。
然后用镊子提起横膈膜正下方的皮肤,并用剪刀切开皮肤。围绕鼠标的圆周横向切割以露出腹膜。然后一只手握住下肢和腹部,用另一只手将皮肤向上拉向头部,为小鼠的上半部分脱去手套,露出蝴蝶形的棕色脂肪库或蝙蝠。
接下来,找到 scape 和相应的 bat 仓库。然后使用解剖显微镜小心地去除蝴蝶顶部的任何浅表白色脂肪,并解剖肩胛间棕色脂肪,注意避开任何相关的肌肉。为了分离皮下或 subq 脂肪组织,一只手握住上附件和胸部,另一只手将皮肤向下拉向脚部,以脱去小鼠下半部分的手套并露出三角形腹股沟 subq 沉积物。
然后将鼠标放回仰卧位,仔细解剖 subq 脂肪三角形,将性腺脂肪与腹腔隔离。用剪刀在隔膜正下方横向切开腹膜。然后从横膈膜切开腹膜到直肠,冠状中部,露出腹部器官,并仔细解剖睾丸 epi 和 vasa deia 的两个表皮脂肪库。
为了隔离血管周围脂肪组织,将动物保持在仰卧位,并将上下附件向外伸展。接下来,用镊子抬起剑突,在身体顶部产生张力,然后水平切开横膈膜,露出胸腔的下部。将胸腔向上切开头部,刚好到胸骨的一侧,然后捡起锁骨下方的胸腔。
沿锁骨的下部长度向腋下方向双向切割。胸腔及其内容物现在应该清晰可见。清除该区域的液体后,切开支气管和连接血管以切除肺部并露出心脏。
确定胃和食道后,在胃食管交界处切开食道以释放胃。接下来,确定肠道和周围的肠系膜。从浅表切开肠系膜,然后尽可能靠近直肠切开结肠,以释放胃、肠、结肠、胰腺和脾脏。
切除器官后,切开肝静脉并连接肠系膜,并切除肝脏的所有叶。切掉肾脏周围的内脏层和脂肪,让肾脏在体内附着在主动脉上,作为主动脉不同段的地理标记。然后,当肾脏周围区域畅通无阻时,使用微型剪刀和微型镊子将主动脉与其背侧与脊柱的附着点以及腹侧与食道的附着点分开。
在胸腔中,沿着主动脉从心脏的起点到髂骨区域的分叉处分离。为了分离主动脉脂肪组织,此时可以识别锁骨下血管。从颈部到主动脉根部分离这些血管,以更好地暴露心脏中的主动脉交界处和根部。
然后切除胸腺并切开头臂动脉、左颈总动脉和左锁骨下动脉,以允许心脏运动。最后,使用解剖显微镜观察主动脉周围的血管周围脂肪组织或 P VVA T 层。然后使用微型镊子轻轻地将组织从主动脉中拉出,并使用微型剪刀轻轻地切割 PVAT 与主动脉的附着,从胸部区域开始,刚好高于隔膜所在的位置。
然后用微型镊子轻轻地将组织从主动脉上拉出,用微型剪刀轻轻地切割 PVAT 与主动脉的附着,从隔膜所在位置的上方的胸部区域开始。重复此过程,主动脉的整个长度在肾下主动脉区域结束,该区域位于主动脉血管髂分叉处的上方和肾分支蝙蝠的下方。wat 样品可以通过组织学分析进行区分,对皮下脂肪细胞和血管周围原代细胞系进行 h 和 e 染色。
然后可以培养脂肪细胞并从前脂肪细胞分化为脂肪细胞以进行微阵列分析。在这些代表性图像中,例如,用油红 O 染色脂肪细胞证实了培养的前脂肪细胞向脂肪细胞的转化,通过该方法分离、培养和分化可用于进一步的体外分析。在这个代表性实验中,与未处理的对照相比,观察到 MM P 2 在离体血管周围脂肪细胞中响应实验处理而降低。
在尝试此程序时,请务必记住更换手套并经常清洁仪器,以尽量减少污染。因此,在收集这些组织后,可以对它们进行各种程序。例如,细胞培养、组织学分析、蛋白质测量,甚至基因表达。
然后,这些结果可用于帮助了解不同仓库之间的关系以及异同。
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本协议概述了从成年小鼠中识别和切除脂肪储存库的方法,以便后续分析。该方法允许最少的解剖和污染,便于对脂肪组织进行各种研究。