Name: Mínimo procedimiento quirúrgico invasivo de inducir infarto de miocardio en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-04T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Aprende a inducir infarto de miocardio en ratones mediante un procedimiento mínimamente invasivo con alta reproducibilidad. Esta técnica utiliza intubación microscópica y ligadura de la arteria coronaria descendente izquierda.

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Este trabajo fue apoyado por el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica IZKF Aachen (grupo de investigación junior de E.A.L.) dentro de la facultad de Medicina de la Universidad RWTH de Aquisgrán. Agradecemos al Dr. Rusu y Ashley Christina Vourakis por la revisión crítica del manuscrito y a la Sra. Roya Soltan por su ayuda profesional con la tinción inmunohistoquímica.

NOTA: Los experimentos presentados en este trabajo se realizan de acuerdo al bajo alemán y de las directrices europeas para el cuidado de los animales. Los animales son criados en las instalaciones de los Animales de Laboratorio Instituto de Ciencia Animal, Universiy hospital de Aquisgrán, Alemania, bajo la supervisión del Prof. Dr. R. Tolba y el Dr. A. Teubner (encargado del bienestar animal). 1. Cuidado de Animales <ol><li> Mantenga los ratones en una unidad de atención especializada, asegurando el acceso adecuado a los alimentos y el control veterinario especializado y tratamiento. Si los animales se mueven o se compran fuera, por favor asegurar un semana antes de someterse al procedimiento. </li></ol> 2. La intubación <ol><li> Anestesiar 8-10 semanas de edad de sexo masculino C57BL / 6 ratones de tipo salvaje, 25-27 g mediante inyección intraperitoneal de 100 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de xilazina. Vigilar el nivel de anestesia por reflejos de pellizco del dedo del pie. Coloca un ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad durante el procedimiento. </li><li&gt; Administrar terapia del dolor con subcutáneamente peso buprenorfina 0,1 mg / kg de peso corporal antes de iniciar el procedimiento quirúrgico, siguiendo las pautas de cuidado de animales de su institución. </li><li> Asegurar el mantenimiento de condiciones estériles para evitar infecciones durante la cirugía mediante el uso de materiales e instrumentos estériles. </li><li> Coloca el ratón anestesiado en posición supina sobre una mesa de cirugía climatizada. Eliminar el pelo de ambos área del cuello ventral y media izquierda del tórax usando una pequeña maquinilla de afeitar y desinfectar con alcohol al 70% antes de la incisión. <ol><li> Realice una pequeña incisión mediana de 0,5 cm utilizando tijeras de cirugía en el centro del cuello. Debajo de la piel, ir a través de los cuerpos grasos 2 con unas pinzas curvas estériles y visualizar la tráquea bajo microscopio estereoscópico a través de la transparencia de la cubierta muscular. </li></ol></li><li> Presentar oralmente la cánula de intubación en la tráquea bajo vista utilizando el microscopio estereoscópico (Figura 1). Distinguir la cánula de metal excelentes referenciasugh el tejido transparente. Y comprobar, la posición y ubicación durante la operación en cualquier momento (Figura 1B). </li><li> Conectar la cánula para el pequeño ventilador para animales y ajustar la configuración de ventilación de acuerdo fabrica directrices (volumen corriente entre 100-150 l y una tasa de respiración entre 100-150 por minuto). </li></ol> 3. Infarto de Miocardio Inducción <ol><li> Realizar una incisión en la piel de menos de 0,5 cm en el medio de una línea entre xifoides y axila izquierda. El uso de fórceps para separar la capa muscular de las costillas subyacentes. </li><li> Realice una pequeña incisión entre las costillas mediante el uso de una pequeña tijera hasta que la cavidad torácica se abre 17. Para miocardio crónico, realizar la incisión en el espacio intercostal 5 TH (Figura 1C) y / o para el modelo de isquemia / reperfusión, en el 4º espacio intercostal (Figura 1D): para un número enfoque más fácil desde debajo de la 2 ª y la 3 ª </sup&gt; espacio intercostal, respectivamente). </li><li> Coloque los retractores en la incisión para abrir la cavidad torácica y para visualizar el corazón. </li><li> Retire con cuidado el pericardio para evitar procesos fibróticos excesivas. </li><li> Visualice la arteria coronaria izquierda descendente (LAD) como un recipiente de color rojo claro profunda posicionado. Si el muchacho no se puede visualizar, considerar algunos puntos de referencia para aumentar la reproducibilidad. <ol><li> Para el modelo de miocardio crónico, coloque la ligadura en el centro de la parte ventral del corazón (entre la aurícula y el ápice), teniendo como referencia la vena como se muestra en la Figura 1C. Enlazar las dos ramas de la arteria mediante sutura de seda 0/7 para obtener una anterior y posterior de miocardio transmural. El color gris indica la posición de la ligadura y se puede repetir si es necesario (Figura 1C). </li><li> Para isquemia modelo / reperfusión, coloque la ligadura bajo la aurícula, sobre el cuerpo principal de LAD (Figura 1D). El ligature se encuentra sobre un tubo de silicona para proteger la integridad de la vasija. El color gris indica la zona infartada y deberá aparecer en todo el corazón (Figura 1D). Coloque suturas temporales en las costillas durante el período de isquemia y humedecer usando una compresa para evitar la desecación de los tejidos. Después de la isquemia, retire el tubo de silicona y cortar la sutura con unas tijeras pequeñas para visualizar la reperfusión. </li></ol></li><li> Al lado de los anestésicos y analgésicos utilizados al principio del procedimiento (pasos 2.1 y 2.2), utilice 0,5% isoflurano durante la cirugía para asegurar el confort adecuado del animal, o seguir las instrucciones de cuidado de animales de su institución. </li></ol> 4. Sutura y Recuperación <ol><li> Eliminar el aire residual del tórax rellenando con una cálida solución salina isotónica. </li><li> Cierre el tórax con 3 suturas 0/6 (como se muestra en la Figura 2A y 2B). Coloque las suturas medial en un ángulo de 90 °, para asegurar comocierre de las costillas ealed, como se muestra en la Figura 2 (Figura 2A, B). </li><li> Cierre la capa muscular con 2 suturas (Figura 2C) y la piel con suturas 3-4 0/6 (Figura 2D). Realizar estas suturas por separado para obtener una ventana adecuada para su posterior medición ecocardiográfica. </li><li> Desconectar la cánula de intubación desde el ventilador y permitir la respiración espontánea. Para la identificación después, marcar el ratón usando el sistema local (informarse con el encargado del bienestar animal de su institución). </li><li> Establecer el ratón en la parte izquierda bajo la luz roja hasta que se despierte. No deje a un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente. No permita que un animal que ha sido sometido a una cirugía para estar en compañía de otros animales hasta que se recupere totalmente. </li><li> Administrar el tratamiento del dolor con buprenorfina 0,1 mg / kg de peso corporal, por vía subcutánea durante los próximos 3 días, siguiendo las pautas de cuidado de animales de su institución. </li&gt; </ol> 5. Análisis de la infarto de miocardio <ol><li> Supervisar regularmente el funcionamiento del corazón por medio de la ecocardiografía (Figura 3): la fracción de eyección, fracción de acortamiento, el gasto cardíaco y las dimensiones del corazón. </li><li> Anestesiar los animales usando inyección intraperitoneal de 100 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de xilazina. Confirmar anestesia adecuada antes de la cirugía por la falta de reflejos. </li><li> Abra la cavidad torácica y extirpar el corazón, colocándolo en estéril lavado solución de PBS ampliamente la sangre restante. </li><li> Si es necesario, recoger la sangre directamente del corazón, evitando la lesión de las regiones infracted, o después de la extracción del corazón, de la cavidad torácica. </li><li> Después del lavado, se detiene el corazón en Diastola en solución KCl saturado (steril filtra 3M KCl en PBS). Para el análisis histológico fijar el corazón en 10% de formalina y proceder con el paso 5.7. </li><li> Si es necesario, medir la viabilidad del cochecélulas diac por cloruro de tetrazolio Evans-Blue / Trifenil (TTC) tinción. Después de la reconstrucción de la ligadura en el lugar inicial, perfundir el corazón con 200 l 1% Solución Azul Evans utilizando una cánula aórtica y congelar el corazón de una pequeña bolsa de plástico a -20 ° C, sin lavar. <ol><li> Después de 2 horas, realice 5 diapositivas transversalmente utilizando un bisturí afilado y incubarlos durante 10-15 minutos en una solución de TTC a 37 ° C, según lo descrito por manufacturado. Fijar los portaobjetos durante 10 minutos en formol al 10% y los puso entre las diapositivas microscópicas para su posterior análisis. </li><li> Insertar el tejido cardíaco en parafina, colocando el corazón en la punta, para realizar el seccionamiento transversal. Realizar la sección de serie de 5 micras. Recoge las primeras 20 secciones y deseche el próximo 300 micras. Continuar el protocolo sección hasta que se ha alcanzado el nivel de la válvula mitral (Figura 3A, B). Serial secciones, 400 micras aparte a lo largo de todo el corazón se recogen y se pueden teñir fo el análisis cualitativo y cuantitativo. </li></ol></li><li> Medir el tamaño del infarto mediante tinción 6-8 de un solo paso de Gomori. </li><li> Analizar la angiogénesis, el contenido de colágeno o células reclutamiento inflamatorio en la sección de serie utilizando tinción inmunohistoquímico usual. </li></ol>

<ol><li>Liehn, E. A., Postea, O., Curaj, A., Marx, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+after+myocardial+infarction%2C+between+fantasy+and+reality%3A+the+role+of+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Repair after myocardial infarction, between fantasy and reality: the role of chemokines.</a> J Am Coll Cardiol. 58 (23), 2357-2362 (2011).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Durante el procedimiento, hay algunos puntos críticos que se destacaron: la intubación, la apertura de la cavidad torácica y la ligadura LAD. El primer paso fundamental es la intubación del animal antes experiements. Muchos grupos están utilizando un soporte vertical para la fijación del ratón y una fuente de luz para insertar la cánula directamente en la tráquea. Este método tiene la incertidumbre relativa a la correcta inserción de la cánula en la tráquea y es el más propenso al fracaso por los novicios. Realización de una pequeña incisión, la posición de la cánula puede ser controlada durante toda la maniobra, lo que disminuye la tasa predeterminada. Por otra parte, la traqueotomía es superada, disminuyendo así las complicaciones y reducir el tiempo de operación. El siguiente paso fundamental es la apertura de la cavidad torácica. La esternotomía media representa una maniobra de alto riesgo retrasar la recuperación de los animales. La incisión lateral izquierdo que implica el corte de 2-3 costillas 15 </sup&gt;, conduce a la recuperación deficiente y aumento de la mortalidad. Se utilizó en el modelo de incisión pequeña, discreta entre las costillas que ofrecen carga mínima. Los animales se recuperan muy rápidamente después de la cirugía y no lo hacen defectos presentes o curación perturbado. El espacio inter-costal inferior se toma como punto de referencia. Teniendo en cuenta esto, el acceso adecuado y diferenciado al lugar de ligadura crónica e isquemia / reperfusión modelo, no plantea problemas serios. La ligadura en sí representa el paso más crítico. La arteria coronaria descendente izquierda es difícil de ser visualizado, y a menudo necesita ser consolidado sin vista. Por lo tanto, algunos puntos de referencia anatómicos se señalan para ayudar al cirujano para realizar la ligadura correcta. Para el modelo de miocardio crónico, la ligadura se coloca en el centro de la parte ventral del corazón, entre la aurícula y el ápice, sobre el final de la vena principal anterior (Figura 2B). La eficiencia se puede controllena mediante la visualización de la aparición del color gris en las zonas afectadas. Si el área infartada aparece anterior y no incluye la pared posterior, una nueva sutura puede ser colocado a la izquierda de la primera sutura. La raíz principal de LAD es siempre visible bajo la aurícula 18, y por lo tanto no presenta serios problemas en la detección de esta parte. Sin embargo, la aurícula presenta el mayor riesgo de sangrado y debe ser manejado con cuidado. El procedimiento está limitado por la existencia de un equipo apropiado. Un ventilador y sistema de anestesia apropiada para los animales pequeños son caros y requieren conexiones a gas y sistema de ventilación de la habitación. Además, una estrecha supervisión de los animales es necesario en la primera semana después del procedimiento para detectar la posible clínico. Para examinar la función del corazón durante el experimento, se requieren de alta resolución de ultrasonido, complejo sistema de perfusión Langendorf, o pequeñas mediciones catéter intraventricular, involving altos costos y experiencia adicional. Teniendo en cuenta el infarto de miocardio, no hay métodos alternativos disponibles para reproducir la complejidad de los eventos in vitro. Dependiendo del punto de interés, ex vivo de perfusión de un corazón aislado en el sistema de Langendorff proporciona información sobre la contractilidad, la función del corazón y de la viabilidad miocárdica en respuesta a diferentes estímulos o drogas. Sin embargo, se excluyen todas las interferencias de componentes de la sangre y el sistema inmunológico, y no está indicada para largos estudios de remodelación y la curación después de un infarto de miocardio. Después de realizar el procedimiento de infarto de miocardio, todos los demás análisis funcional se puede llevar a cabo, como mediciones de la presión intraventricular, ultrasonido (sistemas de ultrasonido pequeño de animales) o corazón aislado de Langendorff-perfusión. Por otra parte, todos los análisis biológica y molecular se puede realizar para identificar las células, proteínas, ARNm, microRNAs, genes u otros biomarcadores, que se pueden utilizar como dianas terapéuticas para desarrollar nuevas estrategias de tratamiento para el infarto de miocardio.

El infarto de miocardio es una de las principales causas de muerte en los países industrializados. A pesar del progreso innegable de los enfoques diagnósticos y terapéuticos, las enfermedades cardiovasculares siguen siendo la principal causa de mortalidad. Dada la esperanza de vida mejorado y riesgos relacionados con la vida, se espera un aumento continuo de la incidencia de enfermedades cardiovasculares en el futuro. Por lo tanto, existe una fuerte necesidad de establecer y validar nuevos enfoques para el tratamiento de la enfermedad cardiovascular. La información de estudios en humanos sufren de sus limitaciones, estos estudios por lo general no son suficientes para explicar y entender los mecanismos a nivel molecular, siendo incapaz de dar soluciones a estos problemas de salud importantes. Por otra parte, la investigación básica ha sido limitada debido a la complejidad y dificultad de reproducir los mecanismos de la enfermedad cardiovascular en el laboratorio. Por lo tanto, para aumentar nuestro conocimiento sobre la fisiopatología de cardioenfermedades vasculares, es esencial para validar modelos animales 1,2. Sin embargo, para identificar todas las cascadas de eventos moleculares implicados en la curación después de infarto de miocardio, el análisis en diferentes puntos temporales es necesario, causando un gran número de animales experimentos. Experimentos con infarto de miocardio con frecuencia se realizan mediante el uso de modelos animales. La inducción de infarto de miocardio en animales pequeños 3-11 es el modelo más adecuado y eficiente empleado para investigar los eventos celulares y moleculares que los modelos animales grandes. Por otra parte, ninguna otra especie presenta la disponibilidad de cepas transgénicas o como ratones knockout 12. Estos modelos de ratón son muy útiles en otras enfermedades, incluyendo patologías cardiovasculares (tales como la aterosclerosis, la restenosis en stent) 13,14. Además, el período de embarazo de bajo y el alto número de progenie califican modelos de ratón como el sistema más atractivo para estudiar los mecanismos moleculares de INFA infartorction 12. Sin embargo, el tamaño del corazón en ratones espera de alta precisión de la manipulación durante la microcirugía. La enseñanza de este personal de cirugía calificados y capacitados es un tiempo y proceso de trabajo intensivo. Por lo tanto, aquí presentamos un procedimiento de microcirugía detallada, incluyendo consejos y trucos para guiar colaboradores, incluso con calificaciones promedio, como los estudiantes o técnicos para llevar a cabo el complejo modelo de infarto de miocardio en ratones. Inicialmente, la intubación se realiza por medio de una cánula corta sin utilizar la traqueotomía. La incisión torácica se encuentra en la zona intercostal, evitando la lesión de nervios o / y el tejido circundante. Esta sub-paso es de gran importancia para asegurar una rápida recuperación y la curación 15. La ligadura se hace diferenciado para los modelos de isquemia crónica y la isquemia / reperfusión, por una alta tasa de supervivencia mientras que todavía mantiene un tamaño significativo de miocardio. Nuestra experiencia muestra that usando sutura de seda asegura una reproducibilidad más alta en comparación con crio-lesiones 16. En conclusión, el método aquí descrito es aplicable tanto en la isquemia crónica y modelos de isquemia / reperfusión en animales pequeños. Los trucos y consejos presentados en este procedimiento están destinadas a permitir que el personal con incluso bajo o promedio de calificación de aplicarlo en modelos animales pequeños.

<table><tbody><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Olympus</td><td>SZ/X9</td><td></td></tr><tr><td>Ventilador de ratón</td><td>Harvard Apparatus 730043</td><td></td><td>Modelo Minient 845</td></tr><tr><td>Sistema de Anestesia Dual (Versión de Mesa)</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td>Unidad de anestesia autónoma a base de isoflurano para uso en mesas de laboratorio, con un tamaño compacto de 8" x 11".</td></tr><tr><td>cánula de intubación</td><td>Harvard Apparatus</td><td>732737</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>FST, Alemania</td><td>9119700</td> punta <td>estándar curvada 0,17 mm x 0,1 mm</td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>FST, Alemania</td><td>9146011</td><td>recta</td></tr><tr><td>Tijera Vannas</td><td>Aesculap, Alemania</td><td>OC 498 R</td><td></td></tr><tr><td>Retractores</td><td>FST, Alemania</td><td>1820010</td><td>2,5 mm de ancho</td></tr><tr><td>Retractores</td><td>FST, Alemania</td><td>1820011</td><td></td></tr><tr><td>Mangos de alambre de</td> 5 mm <td>de ancho FST, Alemania</td><td>1820005</td><td>&nbsp; 10 cm</td></tr><tr><td>Mangos de alambre</td><td>FST, Alemania</td><td>1820006</td><td>&nbsp; 14 cm</td></tr><tr><td>Ketamina 10%</td><td>CEVA, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xilacina 2%</td><td>Medistar, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bepanteno crema para ojos y nariz</td><td>Bayer, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de silicona</td><td>IFK Isofluor, Alemania</td> hecho <td>a medida&nbsp; diámetro del producto</td><td>500 y micro; </td></tr><tr><td>m espesor de la sección 100 y micro; m</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>catéter</td><td></td><td></td><td></td>de politetrafluoretileno</tr><tr><td>PROLENE Suture 6/0&nbsp;</td><td>ETHICON</td><td>8707H</td><td>sutura monofilamento de polipropileno, irreabsorbible, aguja CC1, 13 mm, 3/8 Círculo</td></tr><tr><td>7/0 Seda</td><td>Seraflex</td><td>IC 1005171Z</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonidos&nbsp;</td><td>Vevo, Canadá</td><td>770 Vevo</td><td></td></tr></tbody></table>

mínimo procedimiento quirúrgico invasivo de inducir infarto de miocardio en ratones

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

El infarto de miocardio sigue siendo la principal causa de muerte en los países occidentales, a pesar de los considerables progresos en el área de desarrollo de stent en las últimas décadas. Para el esclarecimiento de los mecanismos subyacentes y el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas, la disponibilidad de modelos animales válidos son obligatorios. Puesto que necesitamos nuevos conocimientos sobre mecanismos patogénicos de las enfermedades cardiovasculares en condiciones in vivo para luchar contra el infarto de miocardio, la validez del modelo animal es un aspecto crucial. Sin embargo, la protección de los animales son de gran relevancia en este contexto. Por lo tanto, establecemos un modelo mínimamente invasivo y sencillo de infarto de miocardio en ratones, lo que asegura una alta reproducibilidad y la tasa de supervivencia de los animales. Por lo tanto, este modelo cumple con las exigencias del principio 3R (reemplazo, refinamiento y reducción) para los experimentos con animales y asegurar la información científica necesaria para su posterior desarrollo de estrategias terapéuticas para cardiovenfermedades ascular.

El procedimiento de infarto de miocardio se produce dentro de 25 a 30 minutos y muestra una tasa de mortalidad del 10%. Después de la cirugía, los ratones se recuperan de la anestesia en los próximos 15 minutos. Sin impedimento físico se observó que el ratón funciona. Sin embargo, hay un mayor riesgo de ruptura del corazón una semana después de infarto de miocardio post-crónica, si los procesos de reparación son perturbados durante la fase inflamatoria. Desde el corazón es capaz de cambiar significativamente sus dimensiones durante el bombeo, es importante para todos los corazones recogidos para ser detenidos en la misma posición, por ejemplo en Diastola. Esto se puede lograr por perfusión del corazón con una solución de KCl saturado. Aumento de bloques concentración extracelular de K + de las bombas iónicas, disminuye el potencial de reposo de membrana de las células cardíacas, resultando en una detención de la actividad cardiaca diastólica. El área de infarto se puede ver en el análisis de ultrasonido (Figura 3A, panel inferior). En comparación conel miocardio normal, regiones isquémicas aparece delgada y hipocinética (Figura 3A, panel superior). Dependiendo del modelo utilizado, el tamaño del infarto será diferente. El modelo de infarto de miocardio crónico induce circular, transmural del ápice (Figura 3B), mientras que la isquemia / reperfusión induce un, medio de pared delgada y a lo largo de todo el corazón (Figura 3C). Hay muchos métodos para determinar el tamaño del infarto. Si el objetivo es analizar el efecto directo sobre la viabilidad cardiaca, un Evans-Blue / TTC tinción 18 está indicado para ser realizado por lo menos 2 horas después de la reperfusión, para ser capaz de ver cualquier cambio en el miocardio. Las secciones pueden ser analizados inmediatamente (Figura 3B, panel central) después de teñir o se pueden mantener entre portaobjetos de vidrio en formalina durante 2-3 días (Figura 3C, panel central). La zona azul representa el miocardio sano, no se ve afectado por la isquemia. El área roja representa el miocardio viable dentro ªe área isquémica (miocardio riesgo), y el área blanca representa el tejido muerto. Por lo general, el tamaño del infarto se expresa como porcentaje de la zona de riesgo. La cicatriz madura resultante después de la remodelación de procesos se puede medir fácilmente por immunohistolgy mediante la tinción de un solo paso de Gomori. Zonas azules manchados infartados y manchadas de rojo saludables ventriculares (Figura 3B y C, paneles de la derecha) se determinan en la primera sección de cada nivel hasta que la válvula mitral. Para evitar la variación debido a la unión de LAD a diferentes niveles, el infarto de toda la sección se considera y se expresó como un porcentaje del volumen ventricular izquierda total. Un volumen de infarto de 15-20% en el modelo de miocardio crónico y de 10-15% después de modelo de isquemia / reperfusión se puede lograr. Además, el modelo de miocardio crónico induce una dilatación acentuada, no se observa en el modelo de isquemia / reperfusión (Figura 3B y C right panel). Procedimientos de tinción convencionales pueden ser utilizados, tales como: la tinción de CD31 utilizado para revelar la angiogénesis (rojo, Figura 4A) o tinción de actina de músculo liso para determinar miofibroblastos (verde, Figura 4B). Doble tinción de fluorescencia también se puede aplicar para identificar moléculas diana diferentes en el área de miocardio, ya que la ausencia de los cardiomiocitos no da ninguna auto-inmunofluorescencia (Figura 4C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52197/52197fig1.jpg"> Figura 1: Incisión medial y la inserción de la cánula de la intubación (A). La visualización estereomicroscópica de la cánula de metal a través de la transparencia del tejido (B). Los anillos traqueales (flechas azules) y la cánula (flecha negro) se señalan. La incisión intercostal para el mes de miocardio crónicodel y la ligadura de LAD (C). La ligadura se encuentra en medio del corazón (entre la aurícula y el ápice, negro en el panel inferior), tomando como referencia el extremo de la vena (esquemática en azul, panel inferior). Ambas ramas de la arteria deben estar unidos (rojo en el panel inferior). El color gris indica área infartada y aparece en la parte media inferior del corazón (panel inferior derecho). La ligadura para el modelo de isquemia / reperfusión se realiza bajo la aurícula, la unión del cuerpo principal de LAD (rojo en el panel inferior) sobre un tubo de silicio (lado derecho) (D). El color gris indica el área infartada, que está presente en todo el corazón (panel inferior derecho). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52197/52197fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52197/52197fig2.jpg"> Figura 2: (A) y la isquemia / reperfusión modelo (B, panel izquierdo). En vivo de imágenes de las costillas de sutura (C, panel izquierdo ), sutura muscular (C, panel central) y la sutura de la piel (C, panel derecho). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52197/52197fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52197/52197fig3.jpg"> Figura 3: imágenes ecocardiográficas. Imágenes de normal (A, panel superior) y áreas infartadas (A, panel inferior), se adquieren en el eje largo (longitudinal, paneles de la izquierda) o en el eje corto (transversal, paneles de la derecha) .. miocardio inducido por ligadura crónica(B) y por una isquemia hr seguido por reperfusión (C). Evans Blue / TTC de tinción permite la identificación de perfundido (azul) / áreas no perfundido, así como la viable (rojo) / (blanco) miocardio muerto (B, C, paneles de media). Tinción de un solo paso de Gomori permite la identificación de las zonas infartadas (Azules), y los diferencia de las regiones normales (rojo) (B, C, paneles de la derecha). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52197/52197fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52197/52197fig4.jpg"> Figura 4: diferentes coloraciones se pueden realizar en la zona infartada, como se describe a CD31 neo-angiogénesis (A, simples, flechas rojas), o actina de músculo liso para miofibroblastos (B g,reen, flechas simples), así como doble tinción (C, CD31-rojo / verde-actina del músculo liso), contratinción con DAPI para los núcleos (azul). Los miofibroblastos se pueden diferenciar fácilmente de las células del músculo liso de las arterias pequeñas o grandes, que siempre van acompañados de una capa endotelial (C, flechas). Flechas dobles indican la autofluorescencia eritrocitos. Escala de barras de 50 micras.

Se describe un modelo altamente reproducible para el infarto de miocardio en ratones con manipulaciones mínimamente invasivas. El modelo se puede realizar fácilmente, lo que resulta en una alta reproducibilidad y tasa de supervivencia. Por lo tanto, el modelo descrito reducirá el número de animales requeridos según lo solicitado por el principio de las 3R (Reemplazo, Refinamiento y Reducción).

Mínimo procedimiento quirúrgico invasivo de inducir infarto de miocardio en ratones

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

El objetivo general de este procedimiento es inducir un infarto de miocardio altamente reproducible en ratones con manipulaciones mínimamente invasivas. Esto se logra mediante la intubación bajo un microscopio estereoscópico para controlar la posición de la cánula de intubación durante el procedimiento. En el segundo paso, se realiza una discreta incisión lateral izquierda entre las costillas para abrir la cavidad torácica y facilitar una rápida cicatrización.A continuación, se coloca la ligadura de la arteria coronaria descendente izquierda de acuerdo con la manipulación posterior adecuada. En última instancia, el tamaño y la forma del infarto se pueden evaluar mediante un análisis inmunohistomorfométrico estándar. Las principales ventajas de esta técnica de los métodos existentes son que es mínimamente invasiva, altamente reproducible y de fácil realización, lo que permite a los investigadores con una experiencia mínima con un método aplicarlo en modelos de animales pequeños.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el tamaño del corazón del ratón requiere una alta precisión de manipulación. Durante la microcirugía. Comience colocando un ratón macho anestesiado de ocho a 10 semanas de edad, C 57 BL six wild type en posición supina sobre una mesa de cirugía con calefacción.Después de confirmar el nivel adecuado de sedación mediante un pellizco en los dedos de los pies, aplique ungüento para los ojos al animal y use una navaja pequeña para eliminar el pelo del área ventral del cuello y la mitad izquierda del tórax, desinfecte la piel con etanol al 70% y derm de cría. A continuación, haz una pequeña incisión mediana de 0,5 centímetros en el centro del cuello. Una vez debajo de la piel, pase un par de pinzas curvas estériles a través de los dos cuerpos grasos para facilitar la visualización de la tráquea a través del músculo de cobertura.Con un microscopio estereoscópico, introduzca la cánula de intubación por vía oral en la tráquea. La cánula debe observarse a través del tejido transparente. Después de confirmar la colocación correcta del instrumento, conecte la cánula al ventilador para animales pequeños y ajuste la configuración de ventilación a un volumen corriente entre 100 y 150 microlitros y una frecuencia respiratoria entre 100 y 150 aspiraciones por minuto para inducir un infarto de miocardio.A continuación, haga una incisión de menos de 0,5 centímetros de largo en la piel entre la apófisis xifoides y el Xi izquierdo. Luego, con pinzas, separe la capa muscular de las costillas subyacentes para un infarto crónico. Realizar una incisión en el quinto espacio intercostal para un modelo de reperfusión por isquemia. Realice la incisión en el cuarto espacio intercostal.A continuación, coloque los retractores en la incisión para abrir la cavidad torácica y visualizar el corazón. A continuación, retire con cuidado el pericardio para evitar procesos fibróticos excesivos y visualice la arteria coronaria descendente izquierda como el vaso rojo claro profundamente posicionado. Para el modelo de infarto crónico, se coloca una ligadura en el centro del lado ventral del corazón entre el oráculo y el ápice utilizando como referencia la arteria coronaria descendente izquierda.A continuación, para obtener el infarto transmural anterior y posterior, se utiliza una sutura de seda cero siete para unir ambas ramas de la arteria. Para el modelo de reperfusión por isquemia, se coloca la ligadura debajo del oráculo y sobre un tubo de silicona y el cuerpo principal de la arteria coronaria descendente izquierda. Durante el período de isquemia, colocar suturas temporales en las costillas, humedeciendo las suturas con una compresa para evitar resecar el tejido.Luego, después de la isquemia, retire el tubo de silicona y corte la sutura con unas tijeras pequeñas para visualizar la reperfusión. Después de inducir el infarto, llene el tórax con una solución salina isotónica tibia para eliminar el aire residual. A continuación, cierre el tórax con 3 0 6 suturas, colocando las suturas mediales en un ángulo de 90 grados para asegurar un cierre sellado de las costillas.Cierre la capa muscular con dos suturas, seguidas de un cierre de la piel con tres o cuatro suturas según sea necesario. A continuación, desconecte la cánula de intubación del ventilador para permitir la respiración espontánea marcando al ratón para su posterior identificación, y coloque al animal bajo una lámpara roja hasta que despierte. Para analizar los datos de infarto de miocardio, controle regularmente la fracción de eyección, el acortamiento fraccional, el gasto cardíaco y las dimensiones del corazón mediante ecocardio.En el punto final del experimento, abra la cavidad torácica y extirpe el corazón. Coloque el pañuelo en PBS estéril para un lavado prolongado. Luego, una vez que se haya extraído toda la sangre, detenga el corazón en diástole con una solución saturada de cloruro de potasio y fije el tejido en formalina al 10% durante la noche.Incruste la sección delgada del tejido cardíaco en parafina, colocando la punta del corazón en la parte inferior del bloque de montaje para permitir el corte transversal del tejido. A continuación, recoja 20 secciones en serie de cinco micras, desechando las siguientes 300 micras. Continúe recolectando secciones de 25 micras cada 300 micras hasta que se alcance el nivel de la válvula mitral.A continuación, utilice la tinción de un solo paso de Mori para medir el tamaño del infarto del tejido y realizar la tinción de TTC. Reconstruya la ligadura y use una cánula aórtica para perfundir el corazón con 200 microlitros de solución azul de Evans al 1% y congele el corazón en una pequeña bolsa de plástico a 20 grados centígrados negativos sin lavar. Después de dos horas, use un bisturí afilado para recolectar cinco secciones transversales del tejido e incubar las secciones durante 10 a 15 minutos.En solución TTC a 37 grados centígrados según las instrucciones del fabricante. Después de otros 10 minutos de fijación en formalina al 10%, transfiera las secciones a portaobjetos de microscopio de vidrio. Para análisis histológico.Dependiendo del modelo utilizado, el tamaño del infarto será diferente. El modelo de infarto crónico induce un infarto transmural circular del ápice, mientras que el modelo de reperfusión por isquemia induce una pared media delgada en todo el corazón. Para analizar el efecto directo del infarto sobre la viabilidad cardíaca, la tinción TTC azul de Evans se puede utilizar para revelar el miocardio sano no afectado por la isquemia en azul, el miocardio viable en riesgo dentro del área isquémica en rojo y el tejido muerto en blanco.Por lo general, el tamaño del infarto se expresa como un porcentaje del área de riesgo de los maoríes. La tinción en un solo paso permite la medición de la cicatriz madura que resulta del proceso de remodelación con las áreas ventriculares sanas teñidas de azul y rojas analizadas en la primera sección a partir de cada nivel del tejido cardíaco adquirido antes de la válvula mitral. El infarto de todas las secciones se expresa entonces como un porcentaje del volumen total del ventrículo izquierdo.También se pueden realizar procedimientos de tinción convencionales, por ejemplo, en estas imágenes. Se utilizó la tinción para CD 31 y actina de músculo liso para revelar la presencia de angiogénesis y miofibroblastos en el tejido infartado, respectivamente. Utilice la tinción fluorescente doble para identificar las diferentes moléculas diana en el área del infarto, ya que no se observa autofluorescencia en ausencia de cardiomiocitos.Una vez dominada, esta técnica se puede completar en 25, 30 minutos si se realiza correctamente. Es necesario un tratamiento suficiente del dolor para garantizar una alta reproducibilidad Después de este procedimiento. Se pueden realizar otros análisis funcionales como intraventriculares, mediciones de presión, ecografía o corazón pulmón aislado.Fin de la perfusión.

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Investigación

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Medicine

Medicina

Numerosas manipulaciones genéticas y / o inyecciones intramiocárdica de genes, proteínas, células, y / o los biomateriales se superponen a la dimensión del tiempo en los estudios de agudos de isquemia / reperfusión y la remodelación crónica en ratones. Este video ilustra los procedimientos de microcirugía de la isquemia / reperfusión, la ligadura permanente de la arteria coronaria, y los estudios de inyección intramiocárdica.

Ligadura de las arterias coronarias y la inyección intramiocárdica en un modelo murino de infarto

El procedimiento quirúrgico utilizado para inducir el infarto de miocardio experimental en ratones comienza con toracotomía izquierda entre la tercera y las costillas cuarta con el fin de visualizar la superficie anterior del corazón y el pulmón izquierdo. La arteria coronaria izquierda se ligó, el pecho se cierra y el ratón se le permite recuperarse de manera espontánea.

Técnica modificada para la ligadura de la arteria coronaria en ratones

En este video, describimos un procedimiento quirúrgico para generar un modelo de ratón de infarto de miocardio mediante la ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda.

Generación de un modelo murino de infarto de miocardio: un procedimiento quirúrgico para la ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda en un modelo de ratón

Se introduce un método quirúrgico para inducir experimental de isquemia / reperfusión (I / R) lesión para simular el infarto de miocardio (MI) en modelos de ratón que permite una mayor claridad en el posicionamiento de la ligadura en la arteria descendente anterior izquierda (LAD) para aumentar la reproducibilidad de experimentos en ratones MI.

Un modelo murino de isquemia-reperfusión miocárdica lesión a través de la ligadura de la arteria descendente anterior

Proporcionamos un método fiable para la ligadura de la arteria descendente anterior izquierda (LAD) en un modelo de ratón. Este método es comparativamente menos invasivo que otros métodos, ya que implica intubación endotraqueal, un abordaje de toracotomía del lado izquierdo y toracocentesis. Este método se puede utilizar como modelo para el infarto de miocardio (IM) agudo y crónico.

Murino descendente anterior (LAD) ligadura de la arteria coronaria: un modelo mejorado y simplificado para el infarto de miocardio

Aquí se describe un procedimiento quirúrgico que muestra cómo lograr la ligadura permanente de la arteria coronaria descendente izquierda-anterior en ratones. Este modelo es de gran relevancia para investigar la fisiopatología del infarto de miocardio y los procesos biológicos concomitantes.

Modelo de infarto de miocardio murino usando ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda

Este artículo presenta un método eficiente para realizar isquemia miocárdica y posterior reperfusión crónica en ratas utilizando un enfoque mínimamente invasivo. Además, la función hemodinámica ventricular izquierda de las ratas se evalúa mediante ecocardiografía y métodos aislados del corazón de trabajo.

Método invasivo semiseminal para inducir el infarto de miocardio en ratas y la evaluación de la función cardíaca mediante un sistema cardíaco de trabajo aislado

Bajo la anestesia adecuada, el corazón del ratón se exteriorizó a través del espacio intercostal, y el infarto de miocardio se indujo con éxito mediante la ligadura de la arteria descendente anterior (DA) izquierda utilizando materiales fácilmente disponibles en la mayoría de los laboratorios.

Un método simple modificado para la inducción de infarto de miocardio en ratones

En este trabajo describimos un método sencillo y reproducible que puede inducir infarto de miocardio o lesión por isquemia-reperfusión miocárdica en ratones mediante ligadura de precisión de la arteria coronaria descendente anterior izquierda mediante micromanipulación.

Inducción de infarto de miocardio y lesión por isquemia-reperfusión miocárdica en ratones

Aquí se presenta un procedimiento quirúrgico para la ligadura permanente de la arteria coronaria izquierda en ratones. Este modelo se puede utilizar para investigar la fisiopatología y la respuesta inflamatoria asociada después del infarto de miocardio.

Ligadura de la arteria coronaria izquierda: un modelo murino quirúrgico de infarto de miocardio

Aprende a inducir infarto de miocardio en ratones mediante un procedimiento mínimamente invasivo con alta reproducibilidad. Esta técnica utiliza intubación microscópica y ligadura de la arteria coronaria descendente izquierda.

Mínimo procedimiento quirúrgico invasivo de inducir infarto de miocardio en ratones

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