La intubación mediada intratraqueal (IMIT) instilación: A, Sistema de Entrega de pulmón-específica no invasiva

El objetivo general de este procedimiento es administrar bacterias de forma no invasiva directamente en los pulmones de los ratones. Esto se logra cargando primero un colchón de aire de 150 microlitros en una jeringa hermética al gas, seguido de 50 microlitros de la suspensión bacteriana preparada. En el segundo paso, se intuba un ratón anestesiado con un catéter de calibre 20 utilizando un alambre guía para ayudar a la colocación.

Luego, después de confirmar el éxito de la intubación con un medidor de flujo simple, el inóculo bacteriano se administra a través del catéter directamente al pulmón con una aguja roma de calibre 22 de largo. En última instancia, la intubación mediada por intubación intratraqueal u omitida se puede utilizar para estudiar la enfermedad del tracto respiratorio inferior en ratones, evitando la afectación concurrente del tracto respiratorio superior. La principal ventaja de imit sobre los métodos de inoculación internasal es que esta técnica permite la administración precisa y reproducible de un inóculo directamente a los pulmones.

Debido a que la IIT es una técnica no quirúrgica, también reduce la posibilidad de complicaciones asociadas con los procedimientos quirúrgicos intratraqueales. Aunque este método puede proporcionar un mecanismo fiable para administrar bacterias al pulmón para estudiar la patogénesis, el IMA también se puede aplicar a la administración de otros reactivos, como compuestos ambientales para estudiar el daño pulmonar, la administración de dianas terapéuticas para el tratamiento y la administración de sondas de imagen o ARNs para estudiar la biología pulmonar básica. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con el paso de intubación, ya que el paso requiere un posicionamiento cuidadoso del animal y el endoscopio automático para la inserción de la guía.

La demostración visual de este método es útil, ya que la colocación inicial de la guía en la tráquea es conceptualmente difícil de describir a los nuevos investigadores. 15 horas antes de la instalación, inocule tres mililitros de caldo de cultivo con una sola colonia bacteriana y cultive el cultivo a 37 grados centígrados y un agitador a 200 RPM. Después de 15 horas, centrifugar un mililitro de las células en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y volver a suspender el paladar en un mililitro de PBS.

A continuación, mida una dilución de uno a 10 de la suspensión de reserva bacteriana a un diámetro exterior de 600 para determinar la concentración bacteriana. A continuación, diluya las células bacterianas en PBS hasta la concentración deseada de bacterias por cada 50 microlitros de inóculo. Para la instalación de IIT, los ratones se preparan para IIT mediante la administración de una solución de lidocaína al 2% a un ratón ligeramente anestesiado mediante ratones con aguja de sonda nasogástrica.

Un retorno a la anestesia mientras la lidocaína hace efecto. Ahora extraiga 150 microlitros de aire en una jeringa de rescisión de gas de 250 microlitros, equipada con una aguja roma de calibre 22 de largo. A continuación, avance el émbolo de teflón desde la marca de 150 microlitros hasta la marca de 200 microlitros en el cuerpo de la jeringa para extraer 50 microlitros del inóculo bacteriano cuando la jeringa esté cargada.

LA, un ratón sedado en decúbito supino sobre una plataforma de intubación que asegura al animal por los incisivos en un anillo sin anillas unido a una tira de Velcro conectada a la plataforma. Levante el mouse a una inclinación de 45 grados y luego use un aplicador de micro algodón para retraer la lengua con un movimiento de balanceo con la mano dominante. A continuación, con la mano no dominante, utilice un otoscopio quirúrgico con un especular de intubación para mantener la retracción de la lengua y visualizar la epiglotis.

Luego, sosteniendo un alambre guía enhebrado a través de un catéter de calibre 20 en la mano dominante, intuble el ratón a una profundidad de 10 milímetros dentro de la tráquea y retire el otoscopio. Asegure el catéter con la mano no dominante. A continuación, conecte brevemente al catéter una longitud conectada al señuelo de un tubo transparente de 16 que contenga un tinte de color.

El tinte debe migrar rápidamente hacia adelante y hacia atrás en respuesta a la respiración del animal cuando el animal ha sido intubado con éxito. Inserte la aguja roma de calibre 22 en el catéter y dispense el inóculo directamente en el pulmón con un solo movimiento de fluido. A continuación, retire inmediatamente la aguja y el catéter del animal y devuelva el ratón a su jaula con supervisión hasta que el animal se recupere por completo de la anestesia.

Para evaluar la carga bacteriana del tejido pulmonar infectado, extraiga los pulmones mediante una técnica estéril y coloque el tejido en una bolsa de muestra estéril prepesada de una onza. Después de pesar la bolsa de muestras más los pulmones, agregue un mililitro de PBS estéril al tejido y revenda la bolsa de muestras. A continuación, haga rodar suavemente una pipeta serológica de 25 mililitros sobre la bolsa de muestras para homogeneizar el tejido.

Retire el tejido conectado a través de un filtro de capa de pared de poliéster estéril y trate el homogeneizado con tritton X 100 a una concentración final del 1% para liberar las bacterias. A continuación, utilice una pipeta multicanal para realizar una dilución en serie séxtuple del homogeneizado en una placa de pocillos UBO 96. A continuación, utilice un multicanal de ocho pocillos para colocar las alícuotas de triplicado homogeneizado de 10 microlitros en una placa de agar LBA.

Finalmente, incubar las placas durante la noche a 37 grados centígrados y enumerar las unidades formadoras de colonias al día siguiente. La liberación de las bacterias es altamente eficiente a través de este método, con más del 98% del inóculo aerogénico de pseudomonas recuperado de los pulmones de los animales instilados en este experimento representativo. Además, la instalación de IIT es altamente reproducible independientemente de la concentración del inóculo administrado.

Para visualizar la distribución del material instilado a través del método IIT, se pueden administrar 50 microlitros de tinte azul brillante de Kumasi al 0,1% en los pulmones, como se acaba de demostrar para el inóculo. Nótese la distribución del tinte a todos los lóbulos del pulmón una vez dominado. Este método se puede realizar rápidamente con un equipo de dos investigadores en un tiempo promedio de dos a tres minutos, incluida la anestesia, la inoculación de IMA y la recuperación de la anestesia.

Al intentar este procedimiento, es importante no hacer más de dos intentos fallidos de intubar el ratón. El fracaso de la intubación puede provocar un traumatismo potencial al insertar el catéter en el esófago en lugar de en la tráquea. Muchos patógenos respiratorios, incluidos los que requieren contención de abs L 3, pueden ser administrados de manera efectiva por imed, ya que este procedimiento se puede realizar como lo demuestran los gabinetes de seguridad y, además, por los investigadores que usan protección respiratoria completa, incluido un protector facial.

Hemos demostrado que imit es un método muy preciso y eficiente para la administración de materiales directamente en los pulmones de ratones. Estas propiedades hacen que imit sea muy adecuado para estudios de tipo GLP que requieren sistemas de modelos altamente reproducibles.