利用生物正交反电子需求的Diels-Alder环的预靶向PET成像

以下实验的总体目标是使用 Tet INE 和反式环辛烷之间的生物正交反应进行 PET 成像，预先靶向癌组织。这是通过在抗体在肿瘤处缓慢积累并从血液中清除的间隔期后向荷瘤小鼠注射反式环齿标记的抗体来实现的。将 tetra zine 放射性配体注射到同一只动物中。

放射性配体与肿瘤处的 TCO 标记抗体咔嗒声，因为它是一个小分子，所以它会迅速从血液中清除。由此产生的小动物 PET 成像显示肿瘤的清晰描绘，具有高对比度和高肿瘤与背景活性比。与使用直接标记抗体的 PET 成像等现有方法相比，该技术的主要优点是它提供的高对比度图像，而对患者的辐射剂量仅为其一小部分。

这项技术的影响延伸到治疗，因为预靶向技术可以向肿瘤提供非常高的辐射量，而同时向健康器官和健康组织提供的剂量将非常低。我将与我们实验室的技术人员 Catherine Kaza 一起演示这项技术。合成反应首先将 7 毫克 NH 2 BN Notta 溶解在 600 微升 pH 值为 8.1 的 0.1 摩尔碳酸氢钠中。

检查 pH 值，并在需要时使用 0.1 摩尔碳酸钠的小等分试样将 pH 值调节至 8.1。接下来，将此溶液添加到微量离心管中的 0.5 毫克 TZ NHS 中。让该反应在室温下孵育半小时，同时轻轻搅拌。

TZ NHS 原液可在半小时后溶解在 DMF 或 DMSO 中。通过反相 C 18 HPLC 纯化产物，以去除未反应的 NH 两个 BN notta，其厚度为 254 纳米。TZ NHS 和 TZ BN Notta 的最佳监测范围为 525 纳米。

样品的保留时间因设备而异，但使用 0 至 100 至 100 至 0 丙酮丁腈对水的梯度超过 25 分钟，并使用 4.6 x 250 mm C 18 分析柱，三种化合物的保留时间分别为 16.5 分钟、15 分钟和 10 分钟。将收集的 HPLC eent 冷冻在液氮中，然后用不透明的箔油包裹试管。现在，将冷冻管放入冻干容器中，并在冻干机上放置过夜。

要去除 HPLC 流动相以验证完成的 TZ bn 无顶部前驱体的纯度，请使用质子 NMR 分析 HPLC 和/或 ESI 质谱法。通过在第二个微量离心管中的微量离心管中制备 2.7 毫摩尔的 T-C-O-N-H-S 在 DMF 中溶液来开始该反应。修复每毫升 2 毫克 华 33 溶液在一毫升 PBS pH 7.4 中。

然后，使用少量添加的 0.1 摩尔碳酸钠，将溶液的 pH 值调节到 8.8 到 9.0 之间，但不能更高。接下来，加入相当于活化酯的 8 摩尔当量的 T-C-O-N-H-S 体积。轻轻混合溶液，倒置几次，然后用箔纸包裹。

然后将试管设置为在室温下孵育约一小时，并轻轻搅拌。一小时后，使用预填充的一次性体积排阻脱盐柱从反应中纯化免疫偶联物。向色谱柱中加入 1 毫升反应混合物，然后加入 1.5 毫升 0.9% 无菌盐水。

然后用两毫升 0.9% 生理盐水洗脱人源化 华 33 TCO 产品。用紫外可见分光光度计测量产品的浓度。如果浓度低于所需浓度，则使用 50， 000 分子量的离心过滤器浓缩产品。

首先在微量离心管中制备每毫升 0.5 毫克的 TZ BN notta 溶液。在第二个微量离心管中，将 10 微升制备好的 TZ BN Notta 溶液加入 400 微升 pH 值为 5.5 的 0.2 摩尔乙酸铵缓冲液中。请务必在即将到来的每个步骤之前和之后测量并记录样品的放射性量。

这对于准确计算放射性化学品产量和保存记录至关重要。现在，将 2000 微居里铜 64 添加到 TZ BN Notta 解决方案中。在室温下轻轻搅拌孵育该混合物 10 分钟。

要纯化产品，请使用反相 C 18 HPLC，使用 5 至 95 至 95 至 5 个丙酮丁腈橡胶和 0.1% TFA 在 15 分钟内以水梯度稀释产品。使用旋转蒸发仪去除 HPLC 离子剂后，放射性标记的 tz、BN nota 将在 9.8 分钟洗脱，而游离铜 64 将在 2 至 4 分钟内随溶剂前沿洗脱，将放射性标记产物溶解在 0.9% 无菌盐水中，然后尽快使用该产品。该程序首先将制备好的 HEA 33 TCO 溶液的 Eloqua 在 0.9% 无菌盐水中稀释至 0.5 毫克/毫升的浓度。

然后将 200 微升溶液注入携带异种移植物的小鼠的尾静脉中。让人源化的 33 TCO 循环并在肿瘤中积累 24 小时。24 小时后，在 0.9% 无菌盐水中以每毫升 1.5 毫居里浓度修复铜 64 标记的 TZ BN Notta。

然后使用尾静脉注射在所需时间向小鼠施用 200 微升制备的放射性配体溶液。麻醉鼠标并将其放在小动物宠物扫描仪的床上。应通过鼻锥分娩来维持麻醉，并应使用脚趾捏确认麻醉状态。

此外，为了防止干燥，请涂抹一层薄薄的眼药膏。现在使用静态扫描获取宠物数据，在 350 到 700 公斤电子伏特下有 6000 万个重合事件，并且在成像后以 6 纳秒的巧合时间等待小鼠恢复意识，然后再将其送回笼子，可能与其他小鼠一起。携带表达 SW 1222 结直肠癌的 33 抗原的胸腺裸鼠。

使用所描述的方案检查异种移植物。急性生物分布和 PET 成像实验均表明，预靶向策略能够以出色的图像对比度和高肿瘤与背景活性比描绘结直肠癌异种移植物。在几个小时内，放射性配体在粪便中清除，肿瘤与背景活性比变得相当高。

这种预定位方法中的一些变量需要优化，就像任何成像策略一样。施用 300 μg 抗体 TCO 偶联物而不是 100 μg 导致小鼠心脏中可见的放射性增加，间隔从 24 小时缩短到 12 小时也是如此。在这两种情况下，喀喇叭声反应仍然发生在肿瘤处，这从早期时间点的肿瘤摄取中可以清楚地说明。

然而，喀喇叭声反应显然也发生在血液中，这是不希望的。尝试此过程时，必须实现所有预定位变量的微妙平衡。优化 TCO Immuno偶联物的质量以及注射之间的时间间隔非常重要。

不要忘记，与放射性一起工作可能非常危险，因此在实验期间应采取预防措施，例如佩戴适当的 PPE 并确保始终屏蔽辐射。