Name: Un semplice Critical dimensioni femorale Difetto Modello in Mice (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Scopri come creare difetti critici nel femore di topi utilizzando un pin midollare in acciaio chirurgico per la stabilizzazione. Questo metodo semplice permette di analizzare la guarigione ossea tramite radiografia e istologia.

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Ringraziamo il personale e veterinari presso il Dipartimento di Medicina comparativa, Tempio, Texas Scott &amp; White Hospital, per i loro consigli e la preziosa collaborazione durante lo sviluppo di questa tecnica. Questo lavoro è stato finanziato in parte da L&#39;Istituto per la medicina rigenerativa Programma Fondi, Scott &amp; White RGP concessione # 90172, NIH 2P40RR017447-07 e NIH R01AR066033-01 (NIAMS). Ringraziamo il dottor Suzanne Zeitouni per proofing il manoscritto.

NOTA: Questo protocollo è progettato per nude (Nu / J) femmine di topo (18-25 g, 6 settimane) acquisito da Jackson Laboratories. Dal momento che i ceppi di topi variano leggermente in termini di anatomia e il tasso di crescita, si consiglia che la fabbricazione dei pin è ottimizzato per il ceppo, il sesso e l&#39;età dei destinatari prima dell&#39;impianto in soggetti vivi. Se i ceppi sono accuratamente abbinati, l&#39;accoppiamento ad interferenza tra il perno e osseo cavità è altamente riproducibile. Procedure per l&#39;edilizia abitativa, la dieta e l&#39;allevamento degli animali in generale sono oltre la portata di questo protocollo, ma tutti i topi sono stati alloggiati in conformità con la guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio (8 ° edizione) e politiche istituzionali stabilito dalla cura degli animali e Istituzionale Utilizzare Comitato (IACUC) e Dipartimento di Medicina comparativa (DCM) a Scott e White Hospital. 1. Realizzazione di pin <imgalt = &quot;Figura 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52368 / 52368fig2highres.jpg&quot; /&gt; Figura 2: assemblaggio Pin. (A) Le fotografie del tubo d&#39;acciaio chirurgico nelle varie fasi di montaggio e un taglio cilindro di 4 mm di diametro da 5 millimetri foglio Gelfoam spessore. (B) Dopo la lucidatura il perno montato (sopra), il cilindro Gelfoam sia livellato, posizionato sopra l&#39;acciaio collare (centrale), poi autoclave, risultante in un perno sterile rivestito con Gelfoam essiccato. Questo migliora l&#39;adesione cellulare al sito di lesione e mantiene la direzione di guarigione (sotto). (C) Un femore asportato dotata del perno midollare. (D) Esempi di assiemi pin a vari spessori e lunghezze dimostrando la flessibilità di questo approccio. (E) μCT ricostruzione di un difetto femorale pin-stabilizzato illustra l&#39;interazione del perno con midollare dell&#39;osso trabecolare nella estremità prossimale e distale del femore. <ol><li> Tagliare una lunghezza 9 millimetri di 22 G tubi ipodermico acciaio, e una lunghezza di 3 mm 19 tubo G con un pesante ruota di cut-off 23,8 millimetri in fibra di vetro rinforzata di diametro montato su un utensile rotante. Utilizzare una pinza a punta fine per immobilizzare il tubo (Figura 2A, sopra). Indossare adeguata protezione per gli occhi e gestire utensile rotante con cura. </li><li> Inserire una piccola quantità (circa 10 ml) di adesivo cianoacrilato per mezzo dell&#39;albero 9 mm. Passare il Collare 3 mm su dell&#39;albero 9 mm, fino al centro e torsione di distribuire uniformemente il collante tra il collare e l&#39;albero. Misurare dimensioni con un paio di pinze digitali e confrontare con la Figura 1. Lasciare riposare per almeno 15 ore (Figura 2A, al centro). </li><li> Utilizzare un disco smeriglio impregnato grana 220 per eliminare sbavature e colla eccessivi. </li><li> Utilizzando lo strumento rotativo, lucidare il perno con un disco di lucidatura feltro. </li><li> Risciacquare con acqua deionizzata e asciugare con Comprearia ssed. </li><li> Integrità test inserendo un ago ipodermico smussato 19 G sull&#39;albero del perno appena fatto e spinta contro il collare. Assicurarsi che il collare può resistere a circa 25 g di peso. </li><li> Sciacquare il perno in sterile filtrata tampone fosfato (Figura 2B, in alto). Assicurarsi che l&#39;albero del perno si inserisce perfettamente nel canale midollare del femore con il filo collare contro i bordi del taglio dell&#39;osso (Figura 2C). Prototype varie configurazioni per gli scopi specifici dello studio e del destinatario (Figura 2D). Assicurarsi che le estremità del perno penetrano nel tessuto osseo trabecolare della diafisi modo da massimizzare fissazione e migliorare l&#39;interferenza (figura 2E). NOTA: Si raccomanda che l&#39;adattamento è testato su campioni ossei prima dell&#39;impianto in topi vivi (ad esempio Figura 2C). </li><li> Utilizzare un 4 mm di diametro punch-biopsia taglierina per tagliare un cilindroda un foglio di spessore 5 mm chirurgica spugna di gelatina. Utilizzare un bisturi per tagliare il cilindro 3 mm di lunghezza e passare un ago ipodermico 20 G lungo la lunghezza del cilindro per generare un foro (Figura 2A, di seguito). NOTA: Abbiamo scoperto che il posizionamento di una gelatina o collagene ponteggio nel sito del difetto migliora la ritenzione cellulare e induce la crescita lungo l&#39;asse longitudinale dell&#39;osso. </li><li> Passare il cilindro in schiuma di gelatina sul perno e allineare con il collare (Figura 2B, centro) e autoclave su un ciclo a secco a 120 ° C a 15 psi. La schiuma di gelatina si asciuga e scurire colore (Figura 2B, in basso). </li></ol> 2. Tecnica chirurgica NOTA: La seguente procedura è scritto rispettando tutte le linee guida fissate dalla Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio (8 ° edizione). Si prega di osservare tutte le politiche aggiuntivefissato dal IACUC locale e garantire un protocollo di uso animale IACUC approvato (o equivalente) sia in posizione prima di procedere con le seguenti sezioni. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52368/52368fig3highres.jpg" /> Figura 3: Strumenti chirurgici. (A) Kit chirurgico. Micro-trapano (1), taglio ruota (2), sutura assorbibile (3), sutura esterna (4), lame di bisturi (5), la maniglia bisturi (6), sterili perni midollari avvolti in un foglio (7), profondimetro midollare forma fatta tubo ipodermico (8), pinza sottile naso (9), ratto-denti pinza (10), aghi alesatura smussati (11), i driver ago (12), piccoli hemostats (13), forbici sottili (14), scollaperiostio (15), pinze modificate Kern (16) (B):. Modifiche necessarie per produrre in stile Kern osso-grip per topi. <ol><li> Selezionare una sala chirurgica procedura o di laboratorio pulito con una porta chiudibile e non nel traffico. Sterilizzare un surfac lavoro adeguatoe con un detergente disinfettante a base-quaternario grado clinico. </li><li> Indossando guanti sterili monouso e vestaglia, ha istituito un campo sterile di circa 60 x 90 cm 2 sul piano di lavoro igienizzata con drappi di stoffa autoclave. NOTA: E &#39;consigliabile avere un assistente rimuovere l&#39;imballaggio esterno e presentare i materiali sterili per la creazione del campo di investigatore. </li><li> Posizionare una piastra elettrica sterilizzata montato acqua calda ri-circolatore sul telo e coprire con teli sterili monouso. Warm uno sterilizzatore tallone di temperatura di funzionamento (250-265 ° C, questo richiede fino a 30 minuti). </li><li> Sul campo sterile, organizzare kit chirurgico (Figura 3A) per fornire un comodo accesso a tutti i componenti. Inoltre, fornire garza sterile di cotone (2 x 2 cm 2), sterile Q-punte, una ciotola di acciaio sterile (500 ml) contenente soluzione fisiologica sterile (0,9% w / v) applicatori, e clorexidina disinfettanti / alcool isopropilico chirurgica. </li><li> Assemblare un piccoloUnità anestesia degli animali accanto al campo sterile con una camera di induzione e testata cono in conformità con la guida veterinaria e il manuale utente. Usare l&#39;ossigeno di grado clinico come la fornitura di gas e isoflurano, USP. </li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52368/52368fig4highres.jpg" /> Figura 4: Procedura chirurgica. (AC) Approccio e l&#39;esposizione del femore. (DE) Elevation e tagli. (FK) Alesaggio e dimensionamento dei canali midollari. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52368/52368fig5highres.jpg" /> Figura 5: Procedura chirurgica. (AB) Installazione di pin. (CD) Chiusura. (E) tipica immagine di posizionato correttamente pin 24 ore dopo l&#39;intervento chirurgico. <ol start="6"><li> Collocare un mouse nella camera di induzione del sistema anestesia e set l&#39;uscita 2 L min -1 O 2 e la concentrazione isoflurano al 3% (v / v). <ol><li> Verificare che il mouse è incosciente entro 1 min; aumentare la concentrazione al 4% (v / v) se necessario. Rimuovere il mouse, posto sul campo sterile con la piastra elettrica posizionata sotto e applicare il cono. Trasferimento flusso al cono, e ridurre il isoflurano al 2,5%, attendere altri 20 secondi, e di prova per un adeguato piano chirurgico in conformità con la politica istituzionale. Tipicamente, la mancanza di un riflesso dell&#39;arto posteriore quando spremuto leggermente è adeguato per determinare l&#39;anestesia adeguata. </li><li> Durante tutto il processo, hanno un monitor assistente forte respirazione regolare e la colorazione rosa delle estremità e della regione della bocca per assicurare un adeguato livello di ossigenazione durante dell&#39;inconscio. Regolare l&#39;anestesia in conformità con la guida veterinaria e politica istituzionale, se necessario. Applicare sterile lacrime artificiali lubrificante unguento (15% (v / v) olio minerale, 83% (v / v) whpetrolato ite) per gli occhi. </li></ol></li><li> Ruotare il mouse su un lato con l&#39;arto posteriore rivolto verso l&#39;alto su un nuovo telo monouso. Se necessario, rimuovere pelliccia con un rasoio elettrico o crema depilatoria. Pulire il sito con soluzione salina sterile e rimuovere il telo supplementare con un eccesso di pelliccia. Inserire un nuovo telo fenestrato il mouse in modo da coprire tutte le parti, ma l&#39;intero arto posteriore (Figura 4A), ma mantenere vista della faccia e zampa per monitorare la colorazione e la respirazione. </li><li> Individuare le estremità prossimali e distali del femore e incidere la pelle per 5-10 mm lungo l&#39;asse longitudinale (Figura 4B). Separare lo strato di pelle dalla fascia con un # 15 bisturi, esponendo un approccio laterale al femore via bicipite femorale e vasto laterale. Individuare dove i setti di soddisfare entrambi i muscoli (che è una linea di tessuto bianco contro la colorazione rosa del muscolo). Con un bisturi, sezionare con cura lungo il confine intermuscolare finoil femore è visibile (Figura 4B). </li><li> Sviluppare l&#39;incisione con un scollaperiostio smussato in modo da esporre l&#39;intera diafisi (Figura 4C). Utilizzare l&#39;ascensore per esporre ulteriormente le centrali due terzi del femore avendo cura di preservare il fascio posteriore neurovascolare sul lato mediale (Figura 4D). Raschiare delicatamente tessuti molli fuori dell&#39;osso con un bisturi, e asciugare con un sterile Q-tip o equivalente. </li><li> Individuare il centro del femore con pinze se necessario e segnare con un bisturi sterile o pennarello, quindi segnare 1,5 millimetri prossimale e distale dal centro. Afferrare il femore con un paio di belle dal naso pinze precedentemente modellate nello stile Kern per evitare un&#39;eccessiva pressione sull&#39;osso. NOTA: Le dimensioni esatte per le modifiche sono forniti in Figura 3B. Si consiglia di testare la pinza su un campione eutanasia prima dell&#39;uso per garantire l&#39;osso non si rompe sotto pressione richieded per l&#39;immobilizzazione durante il taglio. </li><li> Utilizzando una multa trapano munito di rotella di taglio raffinato diamante a grana patinata (8 mm di diametro x 0,1 mm di larghezza), fare il primo taglio con l&#39;ascensore in atto per proteggere il tessuto al di sotto (figura 4E). Aumentare il femore taglio a 45 ° mentre tiene saldamente all&#39;estremità della diafisi, fare il secondo taglio, la rimozione di un segmento 3 mm. NOTA: Protezione viso è raccomandato in questa fase. </li><li> Con l&#39;osso immobilizzato da una pinza, risma attentamente le cavità midollare di ogni estremità con un ottuso 23 G ago ipodermico. Utilizzando un pre-made profondità calibro fatta da una lunghezza di 22 G tubo posto in 19 tubi G (Figura 3A, i TEM 8), valutare la profondità della cavità midollare alesato e assicurarsi che sia 3 mm (Figura 4F-K) . Se cavità midollare resiste profondimetro 22 G, risma di nuovo con un ottuso 22 G ago ipodermico. </li><li> Inserire con cautela il perno midollare nella prossimale distale poi midollare cavities portare femore indietro alla sua lunghezza originale e stabilire una stalla 3 mm di aria (Figura 5A, B). Se necessario, applicare una piccola quantità di stress manuale per ottenere un buon accoppiamento con interferenza dello stelo con l&#39;osso corticale del femore. Assicurarsi che il perno si inserisce perfettamente nella cavità midollare di entrambe le parti ed i bordi di taglio dell&#39;osso sono a filo con il collare. Se vi è una lacuna, alesare ancora una volta con un ago smussato 22 G. </li><li> Riposizionare il muscolo e tessuto periferico sul perno e chiudere con un continuo assorbibile 5-0 sutura (Figura 5C). Chiudi incisione cutanea con 5-7 piazza nodo nylon 5-0 punti di sutura e la tenuta con adesivo chirurgico (Figura 5D). </li></ol> 3. Procedure postoperatorie <ol><li> Dopo aver chiuso l&#39;incisione cutanea, ritirare l&#39;anestesia, ma permettono O 2 di rimanere scorre fino il mouse comincia a muoversi; questo dovrebbe richiedere meno di 1 min. Se il mouse resta immobile dopo 5 min diO 2 amministrazione, fare riferimento a politiche istituzionali in materia di intervento veterinario. </li><li> Quando il mouse comincia a muoversi, delicatamente trasferirlo ad una gabbia contenente preferibilmente secco, biancheria autoclavato. <ol><li> Inserire un igloo di tipo nido in ogni gabbia e il mouse si ritirerà in esso, riducendo il movimento. Verificare che il mouse recupera la mobilità arti posteriori 5-10 minuti dopo il recupero della coscienza. </li><li> Eseguire il monitoraggio postoperatorio quotidiana in conformità con le politiche istituzionali. Fornire idratazione gelatinizzato e cibo sul pavimento della gabbia per i primi 5-7 giorni e somministrare analgesia e il monitoraggio postoperatorio in conformità con le politiche istituzionalmente approvate. NOTA: Noi amministriamo 0,05-0,1 mg kg -1 buprenorfina 24 con 0,25 ml di soluzione salina per via sottocutanea, due volte al giorno per i primi 3 giorni e, successivamente, se il mouse non recuperare utility normale. </li></ol></li><li> Dopo le prime 24 ore di recupero, esibirsi dal vivo su animali di imaging a raggi X under anestesia di visualizzare il posizionamento del perno (Figura 4E). Se il perno è dislocata, prendere in considerazione un intervento chirurgico immediato di revisione. </li><li> Al giorno 7 dopo l&#39;intervento chirurgico, rimuovere punti di sutura sotto anestesia e la casa in gruppi in accordo con le politiche di allevamento istituzionale. </li><li> Dopo 2-5 settimane, umanamente euthanize animali secondo l&#39;American Veterinary Medical Association ha approvato metodi di eutanasia 25. NOTA: un&#39;iniezione intraperitoneale di commercialmente disponibile barbiturico-combinazione eutanasia cocktail è efficace e umana, ma le politiche istituzionali locali eutanasia dovrebbero essere seguite. </li><li> Sezionare con attenzione via la arti posteriori esponendo femore prossimale e il bacino dal lato mediale. Premere delicatamente il giunto verso l&#39;interno dal lato laterale dell&#39;arto, mentre staccando la testa del femore dalla dell&#39;acetabolo (la presa anca) con un bisturi. Tagliare restante muscolo e pelle con un bisturi affilato o micro-forbici, rilasciandotutto l&#39;arto formano il bacino. Con un forte paio di rongeurs o forbici pesanti, tagliare la cerva-dell&#39;arto inferiore (tibia / perone) di circa 5 mm al di sotto del ginocchio. NOTA: Si consiglia di tutti i campioni sono memorizzati in modo identico prima dell&#39;analisi. </li><li> Togliere la pelle, ma lasciare il muscolo in luogo. Fissare il tessuto in 10% formalina tamponata supplementato con 10 mM CaCl 2 fissativo per 1 settimana seguito da stoccaggio in tampone fosfato supplementato con 10 mM CaCl 2 per un massimo di 1 mese prima di imaging. Eseguire fissazione e conservazione a 4 ° C. In alternativa, eseguire la scansione di campioni immediatamente senza fissazione. </li></ol> 4. Analisi dei campioni NOTA: Osso guarigione può essere valutata da una grande varietà di metodologie che sono oltre la portata di questo protocollo. Quanto segue è un metodo che abbiamo utilizzato con successo con un esemplare microCT (μCT) imager. Si raccomanda che i seguenti parametri are testato inizialmente, quindi ottimizzata per le esigenze specifiche del progetto. <ol><li> Avvolgere provetta in un sottile strato di film plastico e posizionarlo verticalmente nella camera strumento. Assicurarsi che il femore è perpendicolare alla fase campione per l&#39;intera scansione. Impostare la scansione per i seguenti parametri; Tensione = 29 kV, corrente = 661 μA, potenza = 19 W, dimensione dell&#39;immagine pixel (micron) = 21.00; Rotazione di 360 gradi = yes; Telaio media = a (5); fase di rotazione (gradi) = 1.00, movimento casuale = on. Salva le immagini come file JPEG in una singola cartella di destinazione per scansione (ad esempio figura 6A). NOTA: La scansione deve essere completa in 57 min. </li><li> Utilizzare il software di ricostruzione per generare immagini assiali sulla base dei seguenti parametri; smoothing = a (4), la compensazione disallineamento = on, riduzione anello artefatti = a (5), fascio indurimento correzione (40%), la rotazione CS (gradi) = 0.00. Impostare uscita 2,000-15,000 unità Hounsfield. Salva le immagini come file JPEGin una sola cartella di destinazione per scansione. </li><li> Usando le immagini assiali e software analitico, definire la regione di interesse (ROI) impostando prima prossimale e distale bordi del difetto originale. Raggiungere questo selezionando le sezioni che comprendono solo il collare. Poiché il collare è più spesso del perno midollare, queste sezioni sono facilmente definiti (Figura 6B, sinistra). Escludere il collare dai calcoli disegnando una zona di esclusione intorno (con un margine di 100 micron) e trasferire la zona a ciascuna delle sezioni del ROI (Figura 6B, destra). NOTA: i momenti di inerzia polare, ricostruzioni 3D e calcoli, come il volume di nuovo osso (Figura 6C, D) possono essere facilmente raggiunti tramite il software. </li></ol>

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Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Qui, si descrive un metodo semplice per generare un difetto critico-sized pin-stabilizzato del femore murino utilizzando standard di laboratorio e veterinari. Mentre l&#39;assemblea dei perni e la procedura chirurgica in sé richiede pratica, è bene alla portata di un ricercatore biomedico ben addestrato o veterinario. Il perno è posizionato nel canale midollare senza fissazione aggiuntiva, rendendo il procedimento tecnicamente più fattibile rispetto agli approcci più complicati che impiegano...

Si stima che la metà della popolazione degli Stati Uniti sperimentare una frattura all&#39;età di 65 1. Per i pazienti con fratture trattate chirurgicamente, 500.000 procedure comportano l&#39;uso di un innesto osseo 2 e questo numero è destinato ad aumentare con una popolazione sempre più anziana 3 . Sebbene osso è uno dei pochi organi che ha la capacità di guarire completamente senza cicatrici, ci sono casi in cui il processo non riesce 3,4. A seconda delle circostanze e la qualità del trattamento, 2-30% delle fratture delle ossa lunghe fallire, con conseguente non-union 3,5. Mentre rimane qualche dibattito sulla definizione, pseudoartrosi, lesioni ossee critici-size o non sindacalizzati in genere si riferisce a un infortunio che non guarisce tutta la durata naturale del soggetto 6. Ai fini sperimentali, tale durata è ridotta al tempo medio necessario per la completa guarigione di una ferita di medie dimensioni delle ossa. Lesioni ossee non sindacali si verificano per nummotivi erous, ma i principali fattori includono traumi estremi conseguente gap critico dimensioni, infezione, povero angiogenesi, uso di tabacco, o la capacità osteoregenerative inibito a causa di malattie o 7 anni. Anche se non unioni sono trattati con successo, può costare oltre $ 60.000 al procedimento, a seconda del tipo di lesione e gli approcci impiegati 8. In casi moderati, innesto osseo autologo è impiegato. Questa strategia comporta il recupero di osso da un sito donatore e l&#39;impianto nel sito di lesione. Mentre questo approccio è estremamente efficace, il volume di osso disponibile donatore-derivato è limitata e la procedura prevede un ulteriore intervento chirurgico, che si traduce in dolore persistente in molti pazienti 9,10. Inoltre, l&#39;efficacia dell&#39;innesto osseo autologo dipende della salute del paziente. Sostituti ossei in materiali sintetici o di osso da cadavere elaborati sono disponibili in abbondanza 11-13, ma HAve significative limitazioni, tra cui scarse proprietà di adesione della cellula ospite, ridotto osteoconduttività, e la possibilità di rigetto immunitario 14. Vi è quindi un urgente bisogno di tecnologie di rigenerazione ossea che sono sicuri, efficaci e ampiamente disponibile. La nostra capacità di migliorare le strategie di rigenerazione dell&#39;osso è criticamente dipendente dalla capacità di imitare gravi traumi ossei in animali da laboratorio, ma la generazione e la stabilizzazione di grandi lesioni ossee è tecnicamente impegnativo. Nella maggior parte dei casi, gravi traumi delle ossa lunghe è imitato sperimentalmente stabilendo un difetto che non guarire naturalmente. Anche se può variare con specie 15, questo si ottiene la rimozione completa di un segmento osseo che è maggiore di 1,5 volte il diametro dell&#39;osso sezione 16. L&#39;osso viene poi stabilizzato con un impianto metallico per mantenere il corretto orientamento dei bordi di frattura e consentire la mobilità. A causa della loro piccola dimensione e la fragilitàle ossa lunghe, la creazione di tali lesioni nei topi sono oltre le capacità della maggior parte dei gruppi di ricerca. Come tale, i modelli difettosi delle ossa lunghe sono limitati a ratti e animali più grandi. Tuttavia, i topi offrono notevoli vantaggi di ricerca in quanto possono essere geneticamente modificati e allevati come ceppi immunocompromessi che non rifiutano le cellule e tessuti umani. Per le applicazioni basate sulle cellule umane, i topi immunocompromessi sono attraenti per lavorare con perché sono fisiologicamente ben caratterizzati, facile da casa, redditizio, e facilmente analizzati radiologicamente e istologicamente. Di fondamentale importanza è che i topi immunocompromessi non rifiutano le cellule di specie diverse, tra cui l&#39;uomo. Le loro piccole dimensioni permette anche la sperimentazione di un numero esiguo di cellule o volumi di ponteggi sperimentali in applicazioni ortopediche. Diversi modelli murini ortopedici sono stati segnalati che offrono vari gradi di stabilità ossea 17,18. Quelli systems che si traducono in livelli molto elevati di stabilità, come fissatori esterni e piastre di bloccaggio prevalentemente guarire da ossificazione intramembranosa anche se la guarigione endochondral è stato segnalato 19. Al contrario, quelli che permettono alcune micro e / o macro-motion, come quelle che impiegano i perni midollari non fissati o parzialmente fissi, in genere guariscono con una predominanza di encondrale 20,21. Unione ritardata o difetti non sindacali di ossa lunghe sono particolarmente difficili da realizzare nei topi a causa del livello extra di stabilizzazione necessaria. Tuttavia, una serie di approcci sono stati segnalati, tra cui i perni midollari con chiodi ad incastro, piastre di bloccaggio e fissatori esterni 22. Questi sistemi generalmente funzionano bene, ma data la loro progettazione complicata possono essere tecnicamente difficile da installare. Ad esempio, Garcia et al. 23 escogitato un elegante sistema pin incastro per l&#39;uso nei topi, ma la procedura prevede due incisioni a sito separatos ed una sostanziale modifica del femore per accogliere i perni. Queste procedure sono state eseguite sotto un microscopio da dissezione. Qui, descriviamo un semplice perno midollare femorale con un collare centrale progettata per impedire la chiusura di un deficit ossea 3 mm e anche delineare i bordi originali del difetto. Mentre il perno non è stato fissato all&#39;osso stesso, accurato dimensionamento del diametro del perno e alesatura dei risultati cavità midollare in interferenza sufficiente a minimizzare il movimento torsionale (Figura 1). Con un&#39;attenta selezione di età inbred, genere e topi ceppo corrispondenza, il risultato è un altamente riproducibile ipertrofica non uniondefect 22 che può essere facilmente valutata radiologicamente. Inoltre le regioni di interesse possono essere definite in modo riproducibile dopo micro-tomografia computerizzata (μCT) per la misura di de novo formazione ossea e parametri istomorfologici. I perni sono stati prototipati nel nostro laboratorio utilizzando strumenti facilmente reperibili.<img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52368/52368fig1highres.jpg" /> Figura 1: principio sperimentale sintesi schematica del modello di difetto segmentale.. Il segmento centrale 3 mm un femore murino 9-10 mm viene asportato chirurgicamente (a sinistra). A, 19 calibro tubo di acciaio chirurgico, lunga 3 mm, è passata sopra a 9 mm di lunghezza, 22 G tubo di acciaio inox e fissato con adesivo al centro esatto (a destra). Il perno risultante è montato nei canali midollari dei restanti porzioni prossimali e distali del femore con il collare 19 G sostituzione del segmento 3 mm dell&#39;osso (di seguito, al centro).

<table><tbody><tr><td colspan="4">Assemblaggio perno</td></tr><tr><td>Utensile rotante Dremel</td><td>8220</td><td>o equivalente</td><td></td></tr><tr><td>Disco da taglio per impieghi gravosi</td><td>Dremel</td><td>420</td><td></td></tr><tr><td>Tubo chirurgico 19&nbsp; G</td><td>Piccole parti (Amazon)</td><td>B000FMZ8LY</td><td>OD 1.07&nbsp; mm, ID 0.889&nbsp; mm</td></tr><tr><td>Tubo chirurgico 21&nbsp; G</td><td>Piccole parti (Amazon)</td><td>B000FMZ8YQ</td><td>OD 0.82&nbsp; mm, ID 0,635&nbsp; mm</td></tr><tr><td>Tubo chirurgico 22&nbsp; G</td><td>Minuteria (Amazon)</td><td>B000FMYLZS</td><td>OD 0.719&nbsp; mm, ID 0,502&nbsp; mm</td></tr><tr><td>Tubo chirurgico 23&nbsp; G</td><td>Piccole parti (Amazon)</td><td>B000FN0SY0</td><td>OD 0.643&nbsp; mm, ID 0,444&nbsp; mm</td></tr><tr><td>Colla cianoacrilato</td><td>Loctite</td><td>1365882</td><td></td></tr><tr><td>Disco smerigliato</td><td>Dremel</td><td>413</td><td></td></tr><tr><td>Punta lucidante in gomma</td><td>Dremel</td><td>462</td><td></td></tr><tr><td>Disco lucidante in feltro</td><td>Dremel</td><td>414</td><td></td></tr><tr><td>Spugna di gelatina</td><td>Surgifoam/Ethicon</td><td>1974</td><td></td></tr><tr><td>Taglierina per biopsia a punzone</td><td>Miltex</td><td>33-34</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Chirurgia/post-operatorio</td></tr><tr><td>Pad caldo e pompa di circolazione</td><td>Stryker/Thermocare</td><td>TP700, TP700C, TPP722</td><td></td></tr><tr><td>Copertura spray quaternario</td><td>Steris</td><td>1429-77</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizzatore di perline</td><td>Germinatore/CellPoint Scentific</td><td>Germinator 500</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di anestesia</td><td>VetEquip Inc</td><td>901806 o 901807/901809</td><td></td></tr><tr><td>Anestetico isofluorano</td><td>VETone/MWI</td><td>501017, 502017</td><td></td></tr><tr><td>Disinfettante chirurgico</td><td>Chloraprep/CareFusion</td><td>260449</td><td></td></tr><tr><td>Strumenti chirurgici Strumenti di</td><td>scienza fine</td><td></td><td>vari consigliati</td></tr><tr><td>Protezione facciale</td> di fabbricazione tedesca <td>Splash Shield</td><td>4505</td><td></td></tr><tr><td>Trapano ad alta velocità ricaricabile</td><td>Strumenti di scienza</td><td>fine 18000-17</td><td></td></tr><tr><td>Mola diamantata</td><td>Strauss Diaiond</td><td>361.514.080HP</td><td></td></tr><tr><td>Suture riassorbibili&nbsp;</td><td>Covidien</td><td>UM-213</td><td></td></tr><tr><td>Suture esterne</td><td>Ethicon</td><td>668G</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Gel idratante</td><td>trasparente H2O</td><td>70-01-1082</td><td></td></tr><tr><td>Gel dietetico</td><td>chiaro H2O</td><td>72-01-1062</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Reckitt e Benckser</td><td>12496-0757-01</td><td>sostanza controllata</td></tr><tr><td>Igloo per topi</td><td>Bio Serv</td><td>K3328, 3570,3327</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail per eutanasia</td><td>Euthasol/Virbac</td><td>710101</td><td>sostanza</td></tr><tr> controllata<td colspan="4">Analysis</td></tr><tr><td>Live animal imager&nbsp;</td><td>Orthoscan</td><td>FD Pulse</td><td>o</td></tr><tr><td>unità Micro-CT equivalente e software</td><td>Bruker</td><td>Skyscan1174</td><td>o</td></tr><tr><td>equivalente Sealing film/Parafilm M</td><td>VWR o Fisher</td><td>100501-338, S37441</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">*Le fonti generiche sono adatte per tutti gli altri articoli come gause, tende, indumenti protettivi, attrezzature per la cura degli animali.</td></tr></tbody></table>

un semplice critical dimensioni femorale difetto modello in mice

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

Sebbene l'osso abbia una notevole capacità di rigenerazione, un grave trauma osseo spesso provoca danni che non guariscono correttamente. Infatti, un decimo di tutte le fratture ossee degli arti non riesce a guarire completamente a causa dell'entità del trauma, della malattia o dell'età del paziente. La nostra capacità di migliorare le strategie di rigenerazione ossea dipende in modo critico dalla capacità di imitare gravi traumi ossei negli animali da laboratorio, ma la generazione e la stabilizzazione di lesioni ossee di grandi dimensioni è tecnicamente impegnativa. Nella maggior parte dei casi, un grave trauma delle ossa lunghe viene imitato sperimentalmente stabilendo un difetto che non guarirà naturalmente. Ciò si ottiene mediante la rimozione completa di un segmento osseo più grande di 1,5 volte il diametro della sezione trasversale ossea. L'osso viene quindi stabilizzato con un impianto metallico per mantenere il corretto orientamento dei bordi della frattura e consentire la mobilità. 
A causa delle loro piccole dimensioni e della fragilità delle loro ossa lunghe, l'insediamento di tali lesioni nei topi è al di là delle capacità della maggior parte dei gruppi di ricerca. Pertanto, i modelli di difetti delle ossa lunghe sono limitati ai ratti e agli animali più grandi. Ciononostante, i topi offrono significativi vantaggi di ricerca in quanto possono essere geneticamente modificati e allevati come ceppi immunocompromessi che non rigettano cellule e tessuti umani.
Qui, dimostriamo una tecnica che facilita la generazione di un difetto segmentale nel femore di topo utilizzando apparecchiature standard di laboratorio e veterinarie. Con la pratica, la fabbricazione del dispositivo di fissazione e l'impianto chirurgico sono fattibili per la maggior parte dei veterinari qualificati e del personale di ricerca sugli animali. Utilizzando dati di esempio, forniamo anche metodologie per l'analisi quantitativa della guarigione ossea per il modello.

Mice tipicamente recuperare coscienza e arti posteriori mobilità 5-10 minuti dopo la sospensione di anestesia. Durante i primi 5 giorni, è consigliabile ospitare topi singolarmente e introdurre arricchimento ambientale per impedire l&#39;utilizzo eccesso dell&#39;arto. A questo scopo, igloo di tipo nidi riducono la necessità di costruzione del nido e incoraggiare riposo. Abbiamo anche osservato che la fornitura di cibo e idrogel sul pavimento della gabbia riduce la probabilità di dislocamento pin. Durante il periodo di ...

I modelli animali sono spesso impiegati per imitare gravi lesioni ossee nella ricerca biomedica. A causa delle loro piccole dimensioni, l'insediamento di lesioni ossee stabilizzate nei topi è al di là delle capacità della maggior parte dei gruppi di ricerca. In questo articolo, descriviamo un metodo semplice per stabilire e analizzare i difetti femorali sperimentali nei topi.

Un semplice Critical dimensioni femorale Difetto Modello in Mice

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare un difetto sperimentale semplice di dimensione critica nel femore di un topo. Questo viene ottenuto innanzitutto creando un perno midollare utilizzando un tubo di acciaio chirurgico. Nel secondo passaggio, viene creato un difetto di dimensione critica nel femore di un topo anestetizzato.Il perno viene quindi impiantato per stabilizzare l'osso. In ultima analisi, la radiografia e l'istologia possono essere utilizzate per valutare il grado di guarigione ossea. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di fissare l'osso esclusivamente con le pinze attualmente utilizzate e di assicurarsi che il collare sia allineato al bordo dell'osso tagliato.Iniziare posizionando 10 microlitri di adesivo a base di cianoacrilato al centro dell'asta di un pezzo di tubo ipodermico in acciaio inossidabile da 22 gauge lungo nove millimetri. Far scorrere un collare da tre millimetri lungo l'asta fino a raggiungere il centro, quindi ruotarlo per distribuire uniformemente la colla tra il collare e l'asta, come illustrato qui. È possibile realizzare vari prototipi di configurazioni dei perni in base agli scopi specifici dello studio e del ricevente.Successivamente, misurare le dimensioni del perno con un paio di calibri digitali. Ogni sezione dovrebbe essere lunga circa tre millimetri. Lasciare indurire il collare per almeno 15 ore, quindi utilizzare due dischi impregnati di carta vetrata 20 grit per rimuovere eventuali bave o colla in eccesso.Successivamente, utilizzare uno strumento rotante per lucidare il perno con un disco lucidante in feltro, quindi risciacquare il perno con acqua deionizzata e asciugarlo con aria compressa. Ora, verificare l'integrità posizionando un ago ipodermico smussato calibro 19 sull'asta del perno e spingere l'ago contro il collare per confermare che il collare sia in grado di resistere a un peso di circa 25 grammi. Quindi risciacquare il perno in PBS sterile filtrato e verificare l'adattamento inserendo il perno nella cavità midollare femorale di un campione osseo, assicurandosi che l'asta si inserisca saldamente con il collare a filo dei bordi dell'osso tagliato.Assicurarsi che l'estremità del perno penetri anche nell'osso trabecolare della diafisi, al fine di massimizzare la fissazione e migliorare l'aderenza. Ritagliare un cilindro di gel schiuma di tre millimetri con un bisturi per biopsia cutanea e forare il centro con un ago da 21 gauge. Quindi inserire il cilindro di gelatina schiuma e allinearne il centro con il collare.Infine, sterilizzare il perno in autoclave con un ciclo a secco a 120 gradi Celsius e 15 PSI. La schiuma si asciugherà e scurirà di colore Dopo aver confermato la sedazione mediante il metodo approvato dall'istituzione competente. Iniziare la procedura chirurgica posizionando un animale anestetizzato con gli arti posteriori rivolti verso l'alto su un telo sterile.Applicare un unguento oculare all'animale, quindi, dopo aver rimosso il pelo, coprire l'animale con un telo chirurgico pulito e forato e individuare la lente prossimale e distale del femore. Incidere la cute per cinque-dieci millimetri lungo l'asse longitudinale. Successivamente, utilizzare un bisturi numero 15 per separare lo strato cutaneo dalla fascia, esponendo un accesso laterale al femore attraverso il bicipite femorale per gli MAs e il vasto laterale.Individuare dove si trovano i setti di entrambi i muscoli. Seguire una linea di tessuto bianco rispetto alla colorazione rosa del muscolo, dove il bisturi deve dissezionare con attenzione lungo questo confine intermuscolare fino a rendere visibile il femore. Successivamente, utilizzare un elevatore periosteo ottuso per ampliare l'incisione ed esporre l'intera diafisi.Quindi esporre ulteriormente i due terzi centrali del femore avendo cura di preservare il fascio neurovascolare posteriore sul lato mediale. Utilizzare un bisturi per rimuovere delicatamente i tessuti molli dall'osso, quindi asciugare l'osso con un applicatore sterile a punta di cotone. Ora utilizzare un righello sterile o un calibro per individuare il centro del femore e segnare l'osso a circa 1,5 millimetri in senso prossimale e distale rispetto al centro.Quindi afferrare delicatamente il femore con un paio di pinzette a becco fine precedentemente modellate nello stile corrente ed eseguire il primo taglio utilizzando una trapano fine munito di una lama di taglio rivestita di polvere di diamante, mantenendo l'elevatore in posizione per proteggere i tessuti. Al di sotto, sollevare il femore tagliato a 45 gradi mentre si tiene saldamente l'estremità della diafisi. Eseguire il secondo taglio rimuovendo un segmento di tre millimetri con l'osso immobilizzato dalle pinzette.Asportare con attenzione le cavità midollari di ciascuna estremità utilizzando un ago ipodermico ottuso da 23 gauge. Successivamente, utilizzando un calibro di profondità preconfezionato, costituito da un tratto di tubo da 22 gauge inserito all'interno di un tubo da 19 gauge, verificare che la profondità della cavità sia di tre millimetri. Quando l'osso è pronto, inserire il perno preparato prima nella cavità midollare prossimale e poi in quella distale, per riportare il femore alla sua lunghezza originale e per creare un'apertura stabile di tre millimetri.Verificare che il perno si inserisca saldamente in entrambe le cavità midollari e che i bordi dell'osso tagliato siano allineati con il collare. Quindi riposizionare il muscolo e i tessuti periferici sopra il perno e chiudere con un punto continuo assorbibile cinque zero. Chiudere la cute con punti in nylon a nodo quadrato cinque sette, punti cinque zero e sigillare l'incisione con adesivo chirurgico per animali.Sono stati soppressi secondo le linee guida dell'A VMA e anche in conformità a un protocollo approvato dall'IACUC. Dopo due a cinque settimane, esporre il femore prossimale e il bacino dal lato mediale dell'animale per dissezionare con attenzione l'arto posteriore. Quindi premere delicatamente l'articolazione verso l'interno dal lato laterale dell'arto, utilizzando il bisturi per staccare la testa del femore dall'acetabolo.Utilizzare un bisturi affilato per rimuovere il muscolo e la pelle residui, staccando l'intero arto dalla pelvi. Successivamente, eliminare i tessuti in eccesso e la parte distale dell'arto posteriore circa cinque millimetri al di sotto dell'articolazione del ginocchio ed asportare la pelle, lasciando il muscolo in sede. In seguito, fissare il tessuto in formalina tampone al 10% integrata con un fissativo contenente cloruro di calcio 10 millimolare per una settimana, seguito da conservazione in PBS integrato con cloruro di calcio 10 millimolare fino a un mese prima dell'acquisizione delle immagini.Per analizzare i campioni, avvolgere i tessuti in uno strato sottile di pellicola di plastica. Disporli verticalmente, uno alla volta. Nella camera di imaging micro-CT, impostare la scansione sui seguenti parametri.Tensione a 29 chilovolt, corrente a 661 milliampere, potenza a 19 watt. Dimensione del pixel dell'immagine a 21 micron. Rotazione di 360 gradi a sì, media dei fotogrammi attivata, passo di rotazione a un grado e movimento casuale attivato.Una volta acquisite le immagini, salvarle come file jpeg in una cartella di destinazione unica per ogni scansione. Successivamente, utilizzando le immagini assiali e un software analitico per ciascun file, selezionare le sezioni che comprendono esclusivamente il collare per definire i margini prossimale e distale del difetto originale e per delimitare la regione di interesse. Infine, disegnare una zona di esclusione con un margine di 100 micron intorno al collare per escluderlo dai calcoli, quindi trasferire tale zona a ciascuna delle sezioni all'interno della regione di interesse.Senza intervento terapeutico, i margini del difetto si estendono tipicamente di 0,5 millimetri durante i primi 21 giorni dopo l'intervento chirurgico. Dopo 14-21 giorni di guarigione, il volume dell'osso neoformato può essere facilmente determinato a partire dalle immagini assiali generate dalla scansione micro-TC. Il volume dell'osso nuovo prodotto aumenta nel tempo, ma in genere non supera complessivamente un millimetro cubo.In assenza di intervento terapeutico dopo 21 giorni, il momento polare d'inerzia dell'osso neoformato a 0,25 millimetri dai margini della lesione varia da 0,05 a 0,35 millimetri alla quarta, rispetto a 0,02-0,08 millimetri alla quarta al centro della lesione. La conferma ulteriore della presenza di non-unione nei casi non trattati, come mostrato in questa immagine rappresentativa, è ottenibile mediante la colorazione con il tricromio di Mason su sezioni longitudinali decalcificate, che permette la visualizzazione dell'accrescimento osseo endocondrale con il margine avanzante di cartilagine seguito da osso spugnoso. Sebbene alcuni danni si verifichino inevitabilmente durante la dissezione, se il perno viene rimosso con attenzione, la struttura istologica dell'osso e del tessuto connettivo rimarrà chiara.In alternativa, è possibile eseguire l'inclusione in metilmetacrilato e la sezionatura di campioni non desmineralizzati con il dolore in sede. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in 30 minuti. Dopo questa procedura, su tessuti recuperati possono essere effettuati metodi come CAR TPCR, microarray o immuno blotting per rispondere a ulteriori domande, ad esempio: come determinate cellule di un certo genotipo, proteine o persino composti influenzano la riparazione ossea? Nei nostri studi, utilizziamo cellule umane e proteine umane in topi con sistema immunitario compromesso.

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Medicine

Medicina

Sebbene i modelli murini siano strumenti inestimabili per l'ingegneria del tessuto osseo, i modelli di difetti delle ossa lunghe sono scarsi. Questa necessità ha motivato lo sviluppo del presente protocollo che utilizza una piastra di bloccaggio con quattro viti e una maschera dedicata per eseguire e stabilizzare un difetto riproducibile, femorale, di dimensioni critiche con bassa morbilità.

Istituzione di un segmentale femorale critico-size difetto del modello in topi stabilizzati da osteosintesi Piastra

Questo protocollo descrive una tecnica di osteosintesi mininvasiva utilizzando una vite intramidollare per standardizzato stabilizzazione delle fratture di femore, che può essere usato per analizzare endocondrale ossa guarigione nei topi.

Un modello come minimo dilagante per analizzare Endochondral frattura la guarigione nei topi in condizioni standardizzate di biomeccaniche

Il modello murino di frattura femorale chiusa è una potente piattaforma per studiare la frattura che guarisce e nuove strategie terapeutiche per accelerare la rigenerazione dell'osso. L'obiettivo del presente protocollo chirurgico è quello di generare fratture femorali chiuse unilaterale nei topi utilizzando un asta intramidollare in acciaio per stabilizzare il femore.

La generazione delle fratture chiuse femorale in topi: un modello per studiare la guarigione ossea

Modelli di mammiferi in vivo di difetti ossei critici dimensioni sono essenziali per i ricercatori che studiano i meccanismi di guarigione e terapie ortopediche. Qui, presentiamo un protocollo per la creazione di difetti riproducibile, segmentale, femorale in ratti stabilizzati con fissatore esterno.

Un modello affidabile e riproducibile critiche medie femorale difetto segmentale in ratti stabilizzato con un Fixator esterno personalizzato

Questo protocollo descrive un metodo per eseguire fratture su topi adulti e monitorare il processo di guarigione.

Frattura trasversale del femore del topo con perno stabilizzante

Questo protocollo descrive una procedura chirurgica per l'instaurazione di una frattura diafisaria nel femore dei topi, che viene stabilizzata con un filo intramidollare, per studi di guarigione delle fratture.

Stabilire un modello di frattura del femore diafisario nei topi

Questo studio ha stabilito un modello di difetto semisegmentale femorale nel ratto per valutare le prestazioni meccaniche e osteogeniche dei materiali sostitutivi ossei in condizioni portanti, senza l'uso di fissazioni interne o esterne.

Modello di difetto osseo diafisario semi-segmentale nei ratti per la valutazione delle prestazioni di sostituto osseo nelle regioni portanti

Al fine di valutare nuovi paradigmi terapeutici per il trattamento del glioma, fisiologica modelli pertinenti sono essenziali. Utilizziamo uno impiantabile procedura vite di guida per la creazione di modelli di xenotrapianto intracranica che è più rapido e più sicuro rispetto agli approcci stereotassica.

Un semplice metodo vite Guida per intracranica Studi dello xenotrapianto in topi

Questo articolo descrive un metodo per stabilizzare fratture delle ossa lunghe che si basa sull'applicazione di modificati Ilizarov fissatori...

Creare fratture rigidamente stabilizzati per la Valutazione ossificazione intramembranosa, osteogenesi per distrazione, o guarigione di difetti critici Sized

Questo protocollo descrive l'isolamento di adiposo cellule stromali di lipoaspirate e la creazione di un millimetro 4 critico imprese difetto cranica per valutare rigenerazione scheletrico.

Riparazione di un critico di dimensioni modello Difetto cranica Usando derivate da tessuto adiposo cellule stromali raccolte da Lipoaspirate

Scopri come creare difetti critici nel femore di topi utilizzando un pin midollare in acciaio chirurgico per la stabilizzazione. Questo metodo semplice permette di analizzare la guarigione ossea tramite radiografia e istologia.

Un semplice Critical dimensioni femorale Difetto Modello in Mice

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