Name: Coltivazione di Heligmosomoides polygyrus: Un immunomodulante nematode parassita ei suoi prodotti secreti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Scopri come coltivare Heligmosomoides polygyrus per isolare molecole immunosoppressive con potenziali applicazioni terapeutiche contro allergie e malattie autoimmuni.

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Gli autori sono finanziati dal Wellcome Trust attraverso il finanziamento dell'Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) e del Programme Grant (Y.H., e R.M.M.) e della Fellowship (J.R.G.), del BBSRC (G.C.), dell'American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. e R.M.M.), dell'Asthma UK (H.J.McS.) e della Rainin Foundation (D.J.S. e R.M.M.).

NOTA: Tutte le procedure di questo protocollo vengono eseguite in conformità con le linee guida stabilite dal Regno Unito Home Office e l&#39;Università di Edimburgo Servizi Veterinari. 1. L&#39;infezione di topi Gavage <ol><li> Conservare Heligmosomoides polygyrus L3 larve in acqua distillata per fino a sei mesi a 4 ° C. </li><li> Prima dell&#39;uso, lavare L3 larve tre volte in acqua distillata: centrifugare a 300 xg per 10 min (con freno), rimuovere tutti ma 500 ml di acqua (per evitare di disturbare pellettato larve L3) e risospendere il pellet ogni volta. </li><li> Per il terzo lavaggio, aggiungere acqua per un volume esatto (tipicamente 40 ml) e aspirare 20 l con 200 microlitri punta tagliata per allargare la sua apertura. Inserire due campioni 20 microlitri sulla superficie di un piatto di coltura 60 mm e contare il larve L3 (generalmente mobili, e meglio visto sotto ingrandimento 50X con un microscopio da dissezione). Risospendere il precipitato finale in acqua distillata ad una concentration 2.000 L3 larve per ml. </li><li> Per la produzione del ciclo di vita, infettare da 8 settimane di età F1 (C57BL / 6xCBA) topi con 400 H. polygyrus L3 larve in 200 ml di acqua distillata da sonda gastrica (frenare topi in posizione verticale per la collottola e passare delicatamente l&#39;ago sonda gastrica smussato attraverso la bocca e l&#39;esofago nello stomaco). Agitare accuratamente prima di ogni infezione (larve stabilirsi rapidamente in acqua) e aspirare 200 microlitri in una siringa da 1 ml; utilizzare un ago sonda gastrica dedicato con un&#39;estremità arrotondata. Per infezione sperimentale di topi più giovani (6-8 settimane), o di altri ceppi inbred (ad esempio C57BL / 6 o BALBc), infettare topi con 200 L3 larve. </li></ol> 2. Propagazione e manutenzione di H. polygyrus <ol><li> Inserire carbone nel centro di una grande vasca di plastica e lasciare acqua di rubinetto fredda per eseguire su di esso per un minimo di 30 min (non lavati carbone attivo è tossico per le larve L3). Scaricare l&#39;acqua dalla vasca e posizionare il carboncino su two strati di carta assorbente, lasciando esposta all&#39;aria stanza fino a completa asciugatura. </li><li> Se le uova contenute, raschiare feci prima fuori del colon con una pinza e forbici (se necessario). Se è necessario un gran numero di larve L3, posizionare topi su una griglia metallica e raccogliere pellet fecali per diversi giorni. </li><li> Mescolare le feci con carbone granulato con un rapporto di almeno 1: 1, per ottenere una consistenza appena sufficiente per smorzare aderire filtrare carta. Spalmare uno strato sottile sul centro di una carta da filtro inumidita in una capsula di Petri e collocarlo in una scatola umida (aggiungere qualche tovagliolo di carta umido e un piatto di acqua) al buio per 12-14 giorni. </li><li> Rimuovere L3 larve dal giorno 7 in poi, e raccoglierli in almeno due occasioni, prima che la carta viene scartata. Le larve formano un anello attorno al bordo della carta da filtro; sollevare la carta da filtro dalla capsula di Petri e sciacquare le larve che restano della piastra (utilizzando una pipetta e 5 ml di acqua sterile per piastra) in un tubo da 50 ml. </li><li> Ascensorela carta filtro e raccogliere le larve rimanente lasciato sul piatto con acqua distillata in un tubo da 50 ml. Centrifugare la soluzione effluente a 300 xg per 10 min. Lavare le larve tre volte con acqua distillata e quindi memorizzare a 4 ° C fino a 50 ml di acqua distillata fino all&#39;utilizzo. NOTA: Le larve rimangono vitali e infettiva per almeno 6 mesi. </li></ol> 3. Raccolta di adulti H. polygyrus Worms <ol><li> Preparare la Apparato Baermann modificata anticipo, come mostrato in Figura 1. </li><li> Topi Cull quattordici giorni dopo l&#39;infezione. </li><li> Lavare l&#39;addome con il 70% di etanolo. Tagliare la pelle sopra l&#39;addome e tirare indietro per rivelare la parete addominale anteriore. Fare incisione mediana di entrare nella cavità peritoneale. </li><li> Rimuovere l&#39;intero intestino tenue e crasso (dal duodeno prossimale a distale del retto). Mettere in una capsula di Petri a secco. </li><li> Raddrizzare l&#39;intestino tutta la sua lunghezza; asportare il colon feci contenenti; collocare questo in un piatto a parte per i preparati a base di uova successive. </li><li> Accise L&#39;prossimali 20 cm di intestino tenue che contiene i vermi adulti -identified dal relativamente spessa parete del duodeno e spesso un aspetto rosso a causa dei vermi intra-luminali. Mettere in un (diametro 100 mm) piastra di Petri con 5 ml di soluzione di Hanks &#39;, riscaldato a 37 ° C (due esemplari per piatto). </li><li> Aprire la porzione prossimale dell&#39;intestino verme pieno longitudinalmente con le forbici (forbici rotonde-ended sono i migliori per questo), e raschiare giù all&#39;interno del rivestimento intestinale con due lastre di vetro per rimuovere il worm. Poi scarta parete intestinale pulito. </li><li> Worm punta in piccoli sacchetti di mussola, fiocco chiuso e sicuro con graffette intorno al bordo del imbuto di vetro (Figura 1). </li><li> Riempire imbuto con Solution Hanks &#39;e aggiungere circa 4 piastre di Petri di vermi in ciascun cilindro. </li><li> Collocare il dispositivo in 37 ° C incubatore per 1-2 ore, agitando delicatamente metà a sloggiaredetriti dalla preparazione dell&#39;intestino che può occludere il filtro di mussola. Fare attenzione ad evitare la fuoriuscita di detriti di fuori del sacchetto di mussola - questo farà sì che la contaminazione della preparazione finale HES. Vermi adulti devono hanno lentamente migrate attraverso il panno di mussola e depositato sul fondo della provetta di vetro. Staccare con cautela la provetta dal tubo di gomma di collegamento sopra il lavandino (avendo cura di evitare di perdere i vermi a questo punto). </li><li> Utilizzando una pipetta di plastica, trasferire i vermi in un tubo da 50 ml e lavare sei volte con Hanks &#39;Solution (permettono vermi di stabilirsi con la gravità, rimuovere il supporto con un stripette, aggiungere 40 ml di Hanks&#39; Solution e ripetere cinque volte). NOTA: la cultura verme deve essere mantenuto sterile da questo punto in poi. <ol><li> Spostare una cappa a flusso laminare e lavare altri sei volte in soluzione sterile Hanks &#39;integrato con 100 U / ml di penicillina e 100 ug / ml di streptomicina, pronta per la cultura in vitro. </li></ol></li><li> Contare ilvermi adulti recuperati prendendo due campioni di 20 l scattate con una punta taglio giallo di ampliare la sua apertura; aspettarsi circa il 50% della quantità di larve inoculato. </li></ol> 4. Configurazione culture per HES: Media Preparazione, lavaggio vermi adulti <ol><li> Immergere i vermi di 3.11 in circa 10 ml di RPMI supplementato con 10% Gentamicina per 20 minuti, lasciando il riposo tubo ad angolo per garantire vermi sono completamente coperti. </li><li> Eseguire questa in una cappa a flusso laminare: sciacquare sei volte con soluzione di Hanks &#39;(supplementato con 5 U / ml di penicillina e 5 ug / ml di streptomicina). </li><li> Preparare H. supporti polygrus. </li><li> Il mantenimento della sterilità in una cappa a flusso laminare, a 500 ml di RPMI1640, aggiungere 11,1 ml di 45% di glucosio (concentrazione finale 1,2% come RPMI1640 contenente 0,2% di glucosio), 5 ml di 100x Peniclllin-streptomicina (concentrazione finale 5 U / ml di penicillina, 5 ug / ml di streptomicina), 5 ml di L-glutammina (concentrazione finale 2 mM), e5 ml di gentamicina (concentrazione finale 1%). Non aggiungere FCS. </li><li> Worm aliquotare in fiaschi T25 ventilati, c. 1.000 vermi in 15 ml H. polygyrus supporto per bombola, e posto in posizione verticale in 37 ° C incubatore (5% di CO 2) per 3 settimane. </li></ol> 5. Preparazione di HES <ol><li> Raccogliere HES contenenti coltura da colture ad intervalli di non più di due volte alla settimana, mettendo da parte la prima collezione dopo 24 ore di cultura (a causa di elevati livelli di contaminazione LPS e proteine ​​dell&#39;ospite - possono essere trattati separatamente o scartato). Tenere ogni raccolta differenziata e chiaramente etichettati con la data e il numero lotto. Sostituire con un uguale volume di H. polygyrus supporto in ogni occasione. </li><li> Centrifuga HES contenenti supporti a 400 x g per 5 min. Poi filtrare sterilizzare attraverso 0,2 micron filtri a basso contenuto proteico vincolanti in 50 ml provette. Conservare nella -20 ° C freezer chiaramente etichettato con la data di raccolta senza fine e la data di HES collezione. </li><li> Dopo 21 giorni di raccolta HES della cultura, eliminare i vermi. </li><li> Pool 500-1000 ml di HES surnatante (di solito a magazzino congelato, e non, tra cui la collezione prima 24 ore) e concentrarsi su un filtro di 3.000 MWCO nel dispositivo di ultrafiltrazione in pressione di azoto. NOTA: Fare molta attenzione a non far funzionare il filtro a secco. <ol><li> Per impostare il dispositivo di filtro, prima lavare la parte lucida 3 kDa membrana verso il basso in un bicchiere 1 litro con acqua distillata per 3 x 20 min sotto agitazione. Montare il dispositivo di ultrafiltrazione secondo le istruzioni del produttore con membrana del filtro lato lucido in alto. Mettere in cabinet a 4 ° C e passare 50 ml di acqua distillata attraverso prima di iniziare a concentrarsi HES pool. </li><li> Aggiungere ciascun tubo di HES nel dispositivo di filtrazione come richiesto (100-140 ml al giorno), fino a quando il volume viene concentrata fino a 2-5 ml. </li></ol></li><li> Al fine di rimuovere i contaminanti dal supporto di coltura HES contenenti, aggiungere 50 ml di pyrOgen-libera PBS al dispositivo di filtraggio e poi concentrarsi fino a circa 2 ml. Ripetere questa operazione per due volte (150 ml di PBS in totale). Trasferire HES in una provetta da 15 ml, sterilizzare il filtro (con un filtro da 0,2 micron) in una cappa a flusso laminare e misurare la concentrazione di proteine ​​utilizzando uno spettrofotometro (E 280 = 10) oppure mediante saggio Bradford. </li><li> Aliquotare, etichetta con il numero di lotto e la data, e congelare a -80 ° C. </li><li> Eseguire un test LAL cromogenico secondo protocolli del produttore di ciascun lotto di HES prima dell&#39;uso. Se i livelli di LPS sono superiori a 1 U LPS per 1 mg di proteine, considerare non utilizzare questo batch per esperimenti in vivo o in colture in vitro. </li><li> Trattare i HES raccolti a 24 ore separatamente nello stesso modo; esso conterrà LPS e alcune proteine ​​di accoglienza e, pur non adatto per esperimenti funzionali, è un&#39;utile fonte di singole molecole che possono essere isolati dal monoclonale purificazione dell&#39;anticorpo affinità. </li></ol&gt;

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Il ciclo di vita di H. procede polygyrus in modo affidabile coerente. A seguito di ingestione naturale o sonda gastrica di L3 larve al giorno 0, cisti iniziano a formarsi sotto la sierosa duodenale di giorno 5, progressione di mute larvali e quindi emergendo come vermi adulti nel lume intestinale da giorno 10, le uova possono essere visti in feci da giorno 14 e granulomi sono visibili sulla superficie sierosa duodenale dal giorno 21. Il protocollo descritto sopra (e riassunti in Figura 6) permette la produzione ad alta velocità di H. escretori secernente prodotti polygyrus (HES), oltre al recupero affidabile di vitale L3 larve per future infezioni sperimentali e ciclo di vita. Infezione polygyrus H. ha dimostrato di essere protettivo nei modelli di asma dipendenti OVA o Der p 1 (Casa acari della polvere allergeni) 14. Inoltre, la soppressione di infiammazione delle vie aeree potrebbe essere trasferita con CD4 + CD25 + </sup&gt; cellule T regolatrici CD19 + 14 o CD23 hi cellule B normativi 24 da non sensibilizzati, H. polygyrus -infected topi. Nei modelli di autoimmunità, H. infezione polygyrus ha dimostrato di essere soppressiva nel encefalomielite autoimmune (EAE) modello sperimentale di sclerosi multipla 9, e la soppressione possono essere trasferiti sia con le cellule T CD4 + CD19 + o cellule B da topi infetti 24. Heligmosomoides polygyrus escretori secernente prodotti (HES) modulano la risposta immunitaria e sopprimono l&#39;infiammazione Th2 mediata da una serie di meccanismi (descritti in figura 7), tra cui: a) Inibizione di risposta delle cellule dendritiche alla stimolazione 25, b) induzione di CD4 cellule T regolatorie + Foxp3 + 18. c) il blocco di IL-33 di produzione 20. HES ha dimostrato di essere protettivo quando somministrato unt sensibilizzazione o sfida nel modello OVA-allume di asma 19 e anche quando somministrato per via intranasale con estratto di Alternaria allergene 20, attraverso la soppressione del primo IL-33 rilascio. Evitare la contaminazione di LPS HES è spesso determinante per il successo delle future esperimenti immunologici. Nel protocollo qui delineato, i passaggi critici nella realizzazione di questo sono per garantire che i residui contenuti nei sacchetti di mussola dell&#39;Apparato Baermann non entra la preparazione finale HES (cfr 2,10) e di mettere da parte la soluzione ES dalla prima 24 ore di cultura (vedi 5.1). Negli ultimi anni, HES è stato completamente caratterizzato, a livello proteomica con oltre 370 proteine ​​distinte identificate 26,27. Inoltre, ES dalla 4a tappa larve è stato sottoposto ad analisi proteomica 28. I lavori in corso comprende che caratterizza i principali componenti glycan di HES, noti per essere fortemente immunogenico 3, e secreta micro-RNCome che sono incapsulati in 50-100 nm vescicole o exosomes (Buck et al., Presentati per la pubblicazione). Con la definizione di protocolli riproducibili per la raccolta di ES da questo parassita altamente immunomodulante, e con numerosi dati di proteomica identificano i componenti molecolari HES, la scena è ora impostata per l&#39;identificazione e la sperimentazione terapeutica delle singole molecole da H. polygyrus che può mediare gli effetti fondamentali sul sistema immunitario dell&#39;ospite.

Heligmosomoides polygyrus è un elminti gastrointestinale murino naturale che è strettamente legato al altamente prevalenti parassiti nematodi umani 1. A differenza di altri modelli di nematodi, come Nippostrongylus brasiliensis, H. polygyrus stabilisce costantemente infezione cronica in topi come risultato diretto di molteplici meccanismi potenti immunomodulatori impiega per sopprimere la risposta immunitaria 2. H. polygyrus ha un ciclo di vita diretta: infettiva L3 larve vengono ingerite dalla trasmissione feco-orale (o somministrata mediante sonda gastrica in ambiente di laboratorio), dopo di che migrano verso lo strato sottosierosa del duodeno e incistano prima di tornare al lume intestinale come vermi adulti circa otto giorni dopo l&#39;infezione iniziale. Produzione di accoppiamento e di uova avviene di giorno 10 e si possono raccogliere i vermi adulti per la cultura e la raccolta di prodotti escretore-secrezione da day 14 in poi 3. H. polygyrus interagisce anche con la microflora commensale, con un aumento lattobacilli presenti in topi sensibili infetti 4-6, e aumento dei livelli di H. infezione polygyrus in seguito all&#39;esposizione di topi per lattobacilli 6. Infezione attiva con H. polygyrus ha dimostrato di proteggere immunopatologia in molti modelli animali di autoimmunità 7-10, colite 11,12 e allergie 13-16. Vi è pertanto stato grande interesse nel potenziale di molecole escretore secernente da questo parassita (&quot;HES&quot;) a down-modulare patologia in vivo 17,18. In effetti, gli effetti protettivi sono visti dopo il trattamento dei topi con HES prodotti 19 attraverso percorsi che ora vengono identificati 18,20. Qui si descrive un protocollo per la produzione affidabile di Heligmosomoides polygyrus e il recupero dei suoi prodotti secretiche può essere ulteriormente utilizzato per una serie di indagini biochimiche e immunologiche funzionali.

<table><tbody><tr><td>Concentratore Amicon</td><td>Millipore</td><td>5112</td><td>Modello 8050 50 ml http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM _NF-5122</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata di Hanks</td><td>Sigma</td><td>H9394</td><td>500 ml http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&region=GB</td></tr><tr><td>Penicillina streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td>100 ml http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063</td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>200 MM 100ml https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081</td></tr><tr><td>Carbone attivo</td><td>Merck</td><td>1.09624.0500</td><td>18-35 mesh http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624</td></tr><tr><td>Soluzione di glucosio</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>100 ml 45% soluzione http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&region=GB</td></tr><tr><td>Provette Falcon</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>50 ml http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon</td></tr><tr><td>T25 Flaconi</td><td>Sigma</td><td>CLS430639&nbsp;</td><td>Pallone ventilato da 25 cm http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&region=GB</td></tr><tr><td>Dosaggio cromogenico LAL</td><td>Lonza</td><td>50-647U</td><td>QCL-1000 assay http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15710-049</td><td>100 ml http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>500 ml; senza L-glutammina http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093</td></tr></tbody></table>

coltivazione di<em&gt; heligmosomoides polygyrus:</em&gt; un immunomodulante nematode parassita ei suoi prodotti secreti

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus (precedentemente noto come Nematospiroides dubius, e indicato anche da alcuni come H. bakeri) è un elminti gastrointestinale che impiega più meccanismi immunomodulatori stabilire infezione cronica nel topo e assomiglia molto infezioni prevalenti elminti umani. H. polygyrus è stato ampiamente studiato nel campo della regolazione immunitaria elminti di derivazione ed è stato trovato per sopprimere potentemente modelli sperimentali di allergia e autoimmunità (entrambi con infezione attiva e isolate prodotti secreti). Il protocollo descritto in questo documento descrive gestione del H. polygyrus ciclo di vita per la produzione costante di L3 larve, il recupero di parassiti adulti, e la raccolta dei loro prodotti escretori secernente (HES).

La suscettibilità alle infezioni da H. polygyrus è controllato in larga misura dal background genetico del ceppo di topo (Tabella 1); C57BL / 6 e CBA topi sono altamente suscettibili 21,22. Per la manutenzione del ciclo di vita parassita, l&#39;ibrido F1 tra questi due ceppi è stato scelto per la sua capacità di resistere oneri verme molto elevati senza morbilità (danni eccessivi epiteliale intestinale) rispetto a uno ceppo parentale. Gavage orale di 400 larve L3 viene utilizzato per mantenere il ciclo di vita nei topi F1 (con conseguenti oneri verme adulto mostrati nella Figura 2), mentre una dose di 200 larve L3 è generalmente utilizzato per esperimenti in ceppi inbred omozigoti (ad esempio, C57BL / 6 o BALBc). Tuttavia, questo dosaggio può essere necessario ridurre a seconda di co-fattori ambientali che possono differire tra strutture di animali, come ad esempio variazioni di flora intestinale. I lotti di HES hanno dimostrato effi riproducibilicacia in saggi funzionali e in composizione proteica; Inoltre, quando supernatanti da ogni successiva settimana di coltura sono stati analizzati, fino ad un totale di 4 settimane, i profili proteici sono risultate molto simili (Figura 3). Quando la concentrazione HES viene misurata mediante saggio Bradford (vedi 5.5), il totale proteina è solitamente circa 1 mg / ml (Figura 4). Un metodo alternativo di concentrare HES è con un concentratore centrifugo (es Vivaspin membrane cut-off 3-kDa), in cui i campioni vengono centrifugati fino a 4.000 g in un rotore di centrifuga incernierato, rimuovendo sali tampone e componenti a basso peso molecolare. Concentrazione centrifuga è più adatto a piccoli volumi di elaborazione (1-10 ml) e sono limitati ad un fattore di concentrazione massima di circa 30x. Quando si raccolgono HES, evitare la contaminazione è critica. Per evitare la contaminazione con le molecole di accoglienza, scartiamo HES-containing coltura dal primo 24 ore dopo il raccolto verme adulto dall&#39;intestino mouse. Abbiamo anche quantificare il livello di contaminazione LPS in ogni lotto di HES con un test cromogenico LAL (vedi 5.7). 1 U di LPS equivale a ~ 100 pg LPS e livelli inferiori a questo vengono considerati trascurabili 23. Nelle nostre mani, la maggior parte delle partite di HES sono significativamente al di sotto di questo limite, la concentrazione media di LPS in HES essere 0,23 U / mg (Figura 5). Gli effetti di LPS in modelli in vivo della patologia (ad esempio la soppressione delle risposte asmatici) richiede almeno 10 ng di LPS 23. Quindi in amministrazione vivo di 5 mg HES da un lotto con 100 pg LPS / mg HES includerà 500 LPS pg, anche al di sotto della concentrazione effettiva in cui LPS diventa un problema. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig1highres.jpg" /> Figura 1: Baermann Apparatus Baermann Apparato per la raccolta di adulti H. polygyrus (come descritto nel capitolo 2). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig2highres.jpg" /> Figura 2: media Worm Burden 14 giorni dopo l&#39;infezione con 400 L3 Larve Media verme grava 14 giorni dopo l&#39;infezione con 400 L3 larve. I punti dati riportati sono da 19 round di infezione di topi C57BL / 6xCBA. Media ± SEM mostrato. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig3highres.jpg" /> Figura 3: profili proteici di HES Da settimane consecutive in Cultura profilo SDS-PAGE delle proteine ​​HES raccolti in successive settimane di cultura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig4highres.jpg" /> Figura 4: </strong&gt; quantità finale di HES da 500 ml ES contenenti media Resa di proteine ​​HES da 11 diversi lotti derivati ​​da circa 500 ml di cultura surnatante. Media ± SEM mostrato. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig5highres.jpg" /> Figura 5: LPS Contaminazione di piani HES di contaminazione LPS in 41 lotti di HES misurati con il test ameobocyte Limulus. Concentrazione mediana LPS = 86 U per mg di HES. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig6highres.jpg" /> Figura 6: Animated schematica di H. polygyrus Life Cycle Sintesi delle tappe fondamentali del ciclo di vita dalla sonda gastrica di L3 larve, attraverso il recupero di larve e adulti di vermi all&#39;isolamento di HES. Figura 7: Animated schematica della HES e le sue funzioni principali effetti immunomodulatori di mediatori solubili e exosomes contenuti in HES. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Genotipo (e lo sfondo ceppo) </td><td> Fenotipo infezione primaria </td><td> Riferimento </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ceppi inbred </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A / J, CBA, C3H </td><td> Altamente suscettibile </td><td> 22,29 </td></tr><tr><td> C57BL / 6 e C57BL / 10 </td><td> Suscettibile </td><td> 22,30 </td></tr><tr><td> BALB / c, DBA / 2, 129 / J </td><td> Intermedio </td><td> 22,31 </td></tr><tr><td> NIH, SJL, SWR </td&gt; <td> Bassa sensibilità </td><td> 22,32 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgenici per citochine o recettori delle citochine </td><td></td></tr><tr><td> IL-1β - / - </td><td> Più sensibili </td><td> 33 </td></tr><tr><td rowspan="2"> IL-1R - / - </td><td rowspan="2"> Meno sensibili (a); nessun cambiamento nella sensibilità, ma un aumento dei granulomi (b) </td><td> (A) 33 </td></tr><tr><td> (B) 34 </td></tr><tr><td> IL-2Rβ transgenici (C57BL / 6) </td><td> Resistente </td><td> 35 </td></tr><tr><td> IL-4 - / - </td><td> Fecondità superiore </td><td> 36 </td></tr><tr><td> IL-4R - / - (C57BL / 6 o BALB / c) </td><td> Altamente suscettibile </td><td> 22 </td></tr><tr><td> IL-6 - / - (BALB / c o C57BL / 6) </td><td> Altamente resistente </td><td> 37 </td></tr><tr><td> IL-9 transgenici(FVB) </td><td> Resistente </td><td> 38 </td></tr><tr><td> IL-21R - / - (C57BL / 6) </td><td> Deficiente Th2, diminuzione granuloma gormation </td><td> 39,40 </td></tr><tr><td> IL-25 - / - (BALB / c) </td><td> Più sensibili </td><td> 33 </td></tr><tr><td> IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / c) </td><td> Nessun cambiamento in suscettibilità </td><td> 33 </td></tr><tr><td> TGFβRIIdn (C57BL / 6) </td><td> Alta Th1, maggiore suscettibilità </td><td> 41,42 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgenici per i marcatori di cellule T </td><td></td></tr><tr><td> CD28 - / - (BALB / c) </td><td> Marginalmente superiore fecondità </td><td> 43 </td></tr><tr><td> CD86 (B7-2) - / - (BALB / c) </td><td> Fecondità superiore </td><td> 44 </td></tr><tr><td> OX40L - / - (BALB / c) </td><td> Fecondità Higher &amp;# 160; </td><td> 45 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgenici per innata loci immunitario </td><td></td></tr><tr><td> Tipo 1 recettori per l&#39;interferone (IFNAR) - / - (C57BL / 6) </td><td> La fecondità superiore, più granulomi </td><td> 34 </td></tr><tr><td> MyD88 - / - (C57BL / 6) </td><td> Più resistenti, più granulomi </td><td> 34 </td></tr><tr><td> C-KitW / Wv (WBB6) </td><td> Più sensibili </td><td> 46,47 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: infezioni primari con H. polygyrus in geneticamente diverse e gene-mirata ceppi di topi.

Heligmosomoides polygyrus è un nematode murino con potenti capacità immunomodulanti che ricordano da vicino quelle di altamente prevalenti infezione da elminti umana. Qui si descrive un protocollo per il mantenimento a lungo termine del H. polygyrus ciclo di vita.

Coltivazione di<em&gt; Heligmosomoides polygyrus:</em&gt; Un immunomodulante nematode parassita ei suoi prodotti secreti

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

L'obiettivo generale di questa procedura è raccogliere e analizzare le molecole secrete dai parassiti helmuth a lunga vita che riducono le risposte immunitarie dell'ospite, consentendo così la sopravvivenza dei parassiti. Questo viene ottenuto innanzitutto coltivando i parassiti nel loro habitat naturale, l'apparato intestinale dei topi. Il secondo passaggio consiste nell'isolare i parassiti maturi dai topi dopo l'eutanasia.Successivamente, i parassiti Helmuth vengono coltivati in colture cellulari, in un mezzo che permane per tre settimane, durante le quali rilasciano elevate quantità di molecole escretorie, secretorie o di tipo ES. L'ultimo passaggio consiste nel recuperare e concentrare le molecole rilasciate dai sopranatanti di coltura in lotti di ES per analisi biologiche e biochimiche. Infine, i sopranatanti concentrati possono essere testati direttamente su specifici tipi cellulari in vitro per studiare le variazioni della funzione delle cellule immunitarie oppure somministrati a topi per verificarne la capacità di sopprimere allergie e altre patologie.L'idea iniziale di questo metodo è nata quando abbiamo osservato che la soppressione immunitaria era associata all'infezione da parassiti vivi, indicando un rilascio attivo e continuo di molecole immunosoppressive da parte di parassiti vivi. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni utili sulle infezioni parassitarie, le molecole che scopriamo essere responsabili della soppressione dell'immunità potrebbero rivelarsi molto efficaci nel trattare malattie importanti del mondo occidentale, come allergie, autoimmunità e malattia infiammatoria intestinale. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché i passaggi per il recupero e la lavorazione dei parassiti elmintici sono piuttosto specializzati e richiedono particolare attenzione alla tecnica di coltura asettica.Topi F1 di otto settimane verranno infettati con larve di H polyus per via orale mediante sondino gastrico per la produzione del ciclo vitale di H polyus. Preparare le larve L3 di H polyus a una concentrazione di 2000 per millilitro di acqua distillata, come descritto nel protocollo allegato. Somministrare 400 larve L3 per topo in 200 microlitri prima di ciascuna infezione.A educare la sospensione di larve ribaltandola cinque volte utilizzando una siringa da un millilitro con un ago specifico per gavaggio avente un’estremità arrotondata, aspirare 200 microlitri della sospensione di larve. Per eseguire il gavaggio orale, immobilizzare il topo in posizione eretta afferrandolo per la nuca e inserire delicatamente l’ago da gavaggio smussato attraverso la bocca e l’esofago fino allo stomaco. I vermi adulti e le uova del parassita verranno recuperati dal topo.14 giorni dopo l'infezione, 14 giorni dopo l'infezione. I vermi adulti di *H. polygyrus* sono raccolti dai topi utilizzando un apparato di Bayliss modificato, preparato come mostrato qui. Per iniziare questa procedura, lavare l'addome dell'animale eutanasizzato con etanolo al 70%.Tagliare la pelle sull'addome e tirarla indietro per esporre la parete addominale anteriore. Praticare un'incisione mediana per accedere alla cavità peritoneale. Rimuovere l'intero intestino tenue e crasso dal duodeno prossimale al retto distale.Posizionarlo in una piastra di Petri asciutta. Raddrizzare l'intestino per tutta la sua lunghezza, escindere il colon contenente le feci e posizionarlo in un piatto separato per recuperare successivamente le uova. Successivamente, identificare i primi 20 centimetri dell'intestino tenue che contengono i vermi adulti.Si caratterizza per la parete relativamente spessa del duodeno e spesso presenta un aspetto rossastro a causa dei vermi intraluminali. Escidere questa porzione dell'intestino tenue e collocarla in una capsula di Petri contenente cinque millilitri di soluzione di Hank. Riscaldare a 37 gradi Celsius utilizzando forbici con estremità arrotondate.Aprire longitudinalmente la porzione prossimale dell'intestino piena di parassiti ed eseguire un raschiamento della parete interna della mucosa intestinale utilizzando due lamelle di vetro. Per rimuovere i parassiti, scartare la parete intestinale pulita. Preparare il imbuto con soluzione di Hank.Chiudere con una graffetta un piccolo sacchetto di mussola ed inserire al suo interno i vermi provenienti da due piastre di Petri. Posizionare due sacchetti di mussola su ciascun imbuto di vetro e fissarli con graffette lungo il bordo dell'imbuto. Collocare l'apparato in un incubatore a 37 gradi Celsius per uno o due ore.A metà dell'incubazione, agitare delicatamente l'apparato per rimuovere i detriti dalla preparazione intestinale che potrebbero ostruire il filtro in mussola. Prestare attenzione a evitare lo spargimento di detriti all'esterno del sacchetto di mussola, poiché ciò causerebbe contaminazione nella preparazione finale di HES. Al termine dell'incubazione, staccare con cura il tubo di raccolta dal tubo di gomma di collegamento sopra un lavello utilizzando una pipetta di plastica, trasferire i vermi in un tubo da 50 millilitri e lasciare che i vermi si depositino per gravità.Rimuovere il mezzo con una pipetta. Aggiungere 40 millilitri di soluzione di Hank e lasciare sedimentare i vermi. Ripetere cinque volte per un totale di sei lavaggi. È fondamentale evitare la contaminazione della coltura torbida per il successo di questo protocollo.La coltura di vermi deve essere mantenuta sterile da questo momento in poi. Trasferirsi in una cappa a flusso laminare e lavare la coltura di vermi altre sei volte in soluzione sterile di Hank, integrata con antibiotici, utilizzando una pipetta e raccogliere due campioni da 20 microlitri per contare i vermi adulti recuperati. Si prevede che circa il 50% della quantità di larve inoculate raccolga uova al giorno 14 di infezione, per raschiare le feci dal colon precedentemente escisso con pinzette.Successivamente, mescolare le feci con carbone attivo granulato in un rapporto di almeno uno a uno. Per ottenere una consistenza appena sufficiente ad aderire e riempire un foglio di carta. Spalmare uno strato sottile al centro di un pezzo di carta filtrante inumidita in una piastra di Petri e collocare quest’ultima in una scatola umida e oscura per mantenerla al buio da 12 a 14 giorni.A partire dal giorno sette, iniziare a raccogliere i larvi di L3. Disporli a cerchio lungo il bordo della carta da filtro. Sollevare la carta da filtro dalla piastra di Petri e utilizzare una pipetta per aggiungere cinque millilitri di acqua sterile per piastra, al fine di risciacquare i larvi rimasti sulla piastra.Trasferire i larvi in un tubo da 50 millilitri. Riposizionare la carta da filtro nella piastra e ripetere il prelievo dei larvi al buio su base settimanale per un massimo di un mese. I larvi raccolti vengono quindi lavati come descritto nel testo del protocollo e conservati a quattro gradi Celsius in acqua distillata.Per iniziare questa procedura, immergere i vermi in circa 10 millilitri di soluzione di Hank, integrata con il 10% di gentamicina, per 20 minuti, lasciando il tubo inclinato in modo che i vermi siano completamente ricoperti dopo 20 minuti. Lavare i vermi sei volte con la soluzione di Hank, integrata con antibiotici, e trasferire i vermi in flaconi T 25 ventilati. Posizionare i flaconi in posizione verticale in un incubatore a 37 gradi Celsius per tre settimane, al fine di ottenere un preparato di prodotti escretori-secretori o HES dai vermi.Cultura contenente HES. Il mezzo viene raccolto dalle colture a intervalli non superiori a due volte alla settimana, sostituendolo ogni volta con un volume equivalente di mezzo h polyus. Mantenere ogni raccolta separata e chiaramente etichettata con la data e il numero del lotto, a causa del maggiore rischio di contaminazione con LPS e proteine dell'ospite.Il primo prelievo, effettuato dopo 24 ore di coltura, deve essere messo da parte ed elaborato separatamente oppure scartato. Centrifugare il mezzo contenente HES a 400 × g per cinque minuti. Quindi aspirare il mezzo con una siringa da 50 millilitri e filtrarlo attraverso un filtro da 0,2 micron a bassa ritenzione proteica in provette da 50 millilitri. Successivamente, l'HES Supena raccolto viene concentrato su un filtro con cutoff di 3000 dalton in un dispositivo ad ultrafiltrazione sotto pressione di azoto. Per preparare il dispositivo del filtro, lavare innanzitutto la membrana da tre chilodalton, con il lato lucido rivolto verso il basso, in un becher da un litro contenente acqua distillata, sotto agitazione.Assemblare il dispositivo di ultrafiltrazione seguendo le istruzioni del produttore, con la membrana filtrante posizionata con il lato lucido verso l'alto, collocarlo in un armadio a quattro gradi Celsius e far passare 50 millilitri di acqua distillata prima di iniziare a concentrare l'HES versato. Prestare molta attenzione a non far asciugare il filtro. Aggiungere ogni provetta di HES nel dispositivo di filtrazione secondo necessità, fino a ridurre il volume a due-cinque millilitri, al fine di rimuovere gli aminoacidi e altri componenti del mezzo di coltura tissutale.Dalla preparazione di HES, aggiungere 50 millilitri di PBS privo di pirigeno nel dispositivo di filtrazione e quindi concentrare fino a circa due millilitri. Ripetere questo passaggio due volte. Utilizzando un totale di 150 millilitri di PBS, trasferire un ES in una siringa e filtrare sterilizzando con un filtro da 0,2 micron.Dopo aver misurato la concentrazione proteica, etichettare l'aliquota con il numero di lotto e la data e congelare a meno 80 gradi Celsius. La somministrazione orale di 400 µL a tre larve viene utilizzata per mantenere il ciclo vitale di H poly gyus nei topi F1. Il carico di vermi adulti risultante è mostrato qui.È stato dimostrato che diverse partite di HES presentano un'efficacia riproducibile in saggi funzionali e nella composizione proteica. Inoltre, quando i soprannatanti di ogni settimana successiva di coltura sono stati analizzati, i profili proteici si sono rivelati molto simili fino a un totale di quattro settimane. Quando la concentrazione di TS viene misurata mediante il saggio di Bradford, la proteina totale è solitamente di circa un milligrammo per millilitro.Il rendimento della proteina HES ottenuto da 11 diverse partite, derivate da circa 500 millilitri di surnatante di coltura, è riportato. È fondamentale evitare contaminazioni durante il recupero della HES; a tal fine, i livelli di contaminazione da LPS in 41 partite di HES sono stati misurati mediante il saggio Limulus AAMI CATE. La maggior parte delle partite di HES si è rivelata significativamente al di sotto della soglia di contaminazione raccomandata. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di mantenere una tecnica sterile accurata nell'allestimento delle colture. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro ore se viene effettuata correttamente seguendo il presente protocollo. Altri metodi, come la proteomica, la frazionatura delle proteine e l'analisi di glicani, lipidi e microRNA, possono essere eseguiti al fine di comprendere appieno lo spettro di prodotti molecolari rilasciati da questi parassiti.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come propagare il polilimo. Si coltiva il polio e si raccolgono i prodotti DS dai vermi adulti coltivati per testarne gli effetti sul sistema immunitario. Sebbene questo parassita non sia dannoso per l'uomo, è importante seguire le precauzioni di sicurezza e aderire al protocollo specificato per garantire la riproducibilità tra i diversi lotti di Hess.

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