Eine preiswerte, skalierbare Behavioral Assay zur Messung von Ethanol Sedierung Empfindlichkeit und Rapid Toleranz in
15. April 2015
Einfache Assays zur Messung der Ethanolsensitivität und schnellen Toleranz in Drosophila erleichtern die Verwendung dieses Modellorganismus zur Untersuchung dieser wichtigen ethanolbezogenen Verhaltensweisen. Hier wird ein relativ einfacher, skalierbarer Assay zur Messung der Ethanolsensitivität und der schnellen Toleranz bei Fliegen beschrieben.
Das allgemeine Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Empfindlichkeit gegenüber Alkoholbetäubung bei Fruchtfliegen zu bewerten. Dies wird erreicht, indem Fliegen in Röhrchen gegeben und Alkoholdampf ausgesetzt werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Anzahl der betäubten Fliegen in jedem Röhrchen zu wiederkehrenden Zeitpunkten zu bestimmen, bis alle Fliegen betäubt sind.
Danach wird der Zeitpunkt interpoliert. Wenn 50 % der Fliegen in jedem Kolben sediert sind, zeigen die Ergebnisse einen Index der Zeit, die erforderlich ist, um Fruchtfliegen mit Ethanol zu sedieren. Diese Prozedur wird heute von Simran Sindu, einer Studentin in meinem Labor, demonstriert. Um das Experiment zu beginnen, sammeln Sie Fliegen in frischen Nährbodenkolben in Gruppen von 11 Tieren eines einzelnen Geschlechts innerhalb von bis zu fünf Minuten unter CO2-Beeinflussung und lassen Sie die Fliegen anschließend über Nacht in Nährbodenkolben in einem umweltkontrollierten Raum regenerieren.
Stellen Sie eine Ethanol-Lösung her, indem Sie reines 100%iges Ethanol mit gereinigtem Wasser auf eine Endkonzentration von 85 % verdünnen. Lassen Sie die Lösung vor dem Test über Nacht auf Raumtemperatur zurückkehren. Bereiten Sie ein sauberes, leeres Probengefäß vor, das als Testgefäß dient. Verwenden Sie einen neuen Celluloseacetat-Stopfen, einen Silikonstopfen und ein Milliliter der Ethanol-Lösung für jedes Gefäß mit Fliegen, die getestet werden sollen. Stellen Sie die Raumtemperatur auf 20 bis 25 Grad Celsius und die relative Luftfeuchtigkeit auf 55 bis 65 % ein. Weisen Sie einer weiteren Person die Aufgabe zu, jeder Gruppe von Gefäßen einen eindeutigen Code zuzuweisen und diesen Code für spätere Zwecke zu dokumentieren. Stellen Sie die codierten Gefäße mit den Fliegen im Testraum einige Minuten lang zum Akklimatisieren bereit. Beschriften Sie anschließend die leeren Testgefäße entsprechend den Codes auf den Fliegengefäßen.
Erstellen Sie ein physisches Testprotokoll, indem Sie die Codes in Spalten einer Tabelle eintragen, wobei jede Vial eine eigene Spalte erhält. Verwenden Sie das Testprotokoll als Leitfaden. Ordnen Sie die codierten Futtergefäße mit Fliegen und die leeren Testgefäße in entsprechenden Reihen im Testraum an und überführen Sie die Fliegen nacheinander aus den Futtergefäßen in die passenden, beschrifteten Testgefäße.
Danach sofort Celluloseacetat-Stopfen in die Testfläschchen einführen, bis die Celluloseacetat-Stopfen zwei Zentimeter unterhalb der Fläschchenöffnungen liegen. Für die Zeit-Null-Bewertung. Jedes Fläschchen einzeln mit Daumen und Zeigefinger anfassen.
Tippen Sie dreimal leicht auf den Tisch, um die Fliegen auf den Boden des Gefäßes zu befördern. Warten Sie 30 Sekunden und zählen Sie die Anzahl der bewegungsunfähigen und/oder toten Fliegen. Notieren Sie die Anzahl der bewegungsunfähigen toten Fliegen für jedes Gefäß zum jeweiligen Zeitpunkt.
Null Minuten im handschriftlichen Prüfprotokoll. Starten Sie die Stoppuhr zum Zeitpunkt null und geben Sie sofort ein Milliliter Ethanol zum Celluloseacetat hinzu. Rühren Sie im kreisförmigen Bewegungsablauf in Abständen von fünf Sekunden für den ersten Satz von vier Gefäßen in der vorgegebenen Reihenfolge.
Sie werden getestet, sobald Ethanol zu allen vier Testgefäßen des Satzes hinzugegeben wurde. Setzen Sie einen Silikonstopfen in jedes Gefäß, um es nach 1, 2, 3, 4 und fünf Minuten abzudichten. Geben Sie je einen Milliliter Ethanol in den zweiten, dritten, vierten, fünften und sechsten Satz mit jeweils vier Gefäßen.
Setzen Sie das Einführen der Silikonstopfen fort, nachdem Ethanol zu jedem Satz von vier LS-Gefäßen nach sechs Minuten hinzugefügt wurde. Testen Sie den ersten Satz von vier Gefäßen, indem Sie jedes Gefäß mit Daumen und Zeigefinger festhalten und es dreimal vorsichtig auf den Tisch klopfen, um die Fliegen auf den Boden des Gefäßes zu befördern. Warten Sie 30 Sekunden, zählen Sie anschließend die Gesamtzahl der betäubten Fliegen und notieren Sie diese.
Bewerten Sie die Fliegen als sediert, wenn sie entweder auf dem Boden des Röhrchens stehen, aber nicht laufen, oder auf dem Rücken liegen, mit oder ohne Flügelschlagen. Behandeln Sie jedes Röhrchen innerhalb der Serie im Abstand von fünf Sekunden gemäß diesem Zeitplan: 7, 8, 9, 0 und 11 Minuten.
Testen Sie die zweite, dritte, vierte, fünfte und sechste Vial-Serie jeweils wie die erste Serie nach 12 Minuten. Testen Sie die erste Serie mit vier Vials erneut und setzen Sie die Tests mit der zweiten, dritten, vierten, fünften und sechsten Vial-Serie nach 13, 14, 15, 16 bzw. 17 Minuten fort. Setzen Sie die Tests an den Fliegen fort, bis alle betäubt sind.
Geben Sie die Gesamtanzahl der Fliegen in jedem Gefäß im harten Test ein. Notieren Sie sensorisch unbewegliche oder tote Fliegen zum Zeitpunkt null basierend auf der Gesamtanzahl der Fliegen. Die Rohdaten aus dem Ethanol-Sedierungstest wurden in den Prozentsatz aktiver Fliegen in Abhängigkeit von der Zeit umgewandelt.
Die Empfindlichkeit gegenüber Ethanol-Sedierung wurde anhand der Primärdaten als Sedierungszeit 50 oder ST 50 quantifiziert. Die Zeit, die benötigt wird, bis 50 % der Fliegen sediert sind, oder die Fläche unter der Kurve bzw. AUC. Der Test erfasst die Effekte von RNAi gegen Calnexin 14 D im Nervensystem, die im Vergleich zu Kontrollen die Ethanol-Empfindlichkeit abschwächten, sowie die Mutation von scab und rouser, die die Empfindlichkeit gegenüber Ethanol-Sedierung erhöhte, und die Mutation von happy hour. Die abgeschwächte Empfindlichkeit gegenüber Ethanol-Sedierung im Vergleich zu Kontrollen, sobald beherrscht.
Diese Technik kann in anderthalb Stunden durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.
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Übersicht
Dieser Artikel beschreibt einen einfachen Test zur Messung der Empfindlichkeit gegenüber Ethanol und der schnellen Toleranzentwicklung bei Drosophila. Die Methode ermöglicht die Untersuchung ethanolbezogener Verhaltensweisen in diesem Modellorganismus.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Verhaltensbiologie
- Modellorganismen
Hintergrund
- Die Empfindlichkeit gegenüber Ethanol ist ein wichtiges Verhaltenmerkmal bei vielen Organismen.
- Drosophila dient als wertvolles Modell zur Untersuchung der Wirkungen von Ethanol.
- Das Verständnis der schnellen Toleranzentwicklung kann Einblicke in die Mechanismen der Suchtentstehung liefern.
- Einfache Tests können die experimentelle Zugänglichkeit und Reproduzierbarkeit verbessern.
Zweck der Studie
- Die Empfindlichkeit von Fruchtfliegen gegenüber Alkoholsedierung beurteilen.
- Eine Methode zur Messung der schnellen Toleranz gegenüber Ethanol etablieren.
- Zum Verständnis alkoholbezogener Verhaltensweisen bei Drosophila beitragen.
Verwendete Methoden
- Fliegen werden in Röhrchen gegeben und mit Ethanol-Dampf exponiert.
- Die Anzahl der sedierten Fliegen wird zu wiederkehrenden Zeitpunkten gezählt.
- Die Zeit bis zur Sedierung von 50 % der Fliegen wird interpoliert.
- Fliegen werden in Gruppen gesammelt und vor der Prüfung zur Erholung freigegeben.
Hauptergebnisse
- Der Test misst effektiv die Ethanol-Sensitivität bei Fruchtfliegen.
- Die Ergebnisse zeigen, dass die für die Sedierung benötigte Zeit zwischen Individuen variiert.
- Schnelle Toleranzentwicklung kann durch wiederholte Exposition beobachtet werden.
- Die Methode ist skalierbar und reproduzierbar für weitere Studien.
Schlussfolgerungen
- Dieser Test bietet einen zuverlässigen Ansatz, um die Empfindlichkeit gegenüber Ethanol zu untersuchen.
- Die Ergebnisse können zukünftige Forschungsarbeiten zu Sucht und Toleranz beeinflussen.
- Drosophila bleibt ein wichtiges Modell für die Verhaltensneurowissenschaftliche Forschung.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieser Test bietet einen skalierbaren, kostengünstigen Verhaltensparameter für die Empfindlichkeit gegenüber Ethanol und die schnelle Toleranzentwicklung bei Drosophila und ermöglicht dadurch genetische Hochdurchsatz-Screenings zur Risikominderung bei der Zielvalidierung in der Forschung zu Alkoholgebrauchsstörungen. Durch die Quantifizierung der Kinetik der sedativen Reaktion unterstützt er die mechanistische Risikominderung bei genetischen Treffern und erhöht die Vorhersagesicherheit in frühen Entdeckungsphasen. Die Einfachheit und Reproduzierbarkeit der Methode erleichtern die fachübergreifende Abstimmung zwischen Genetik-, Neurowissenschafts- und translationsorientierten Teams.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem die ethanolinduzierte Sedierung als funktioneller Endpunkt genetischer Modifikationen gemessen wird.
- Operationaler Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch reproduzierbare Quantifizierung sedativer Phänotypen über verschiedene Genotypen hinweg.
- Prädiktiver Wert: Erzeugt Kenngrößen wie die Sedierungszeit 50 (ST50) und die Fläche unter der Kurve (AUC), um Zielstrukturen mit konsistenten Verhaltenseffekten zu priorisieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte, quantifizierbare Ergebnisse (Prozent aktiver Fliegen über die Zeit) zur Verwendung in Screening-Workflows.
- Skalierbarkeit: Für geringe Kosten und einfache Einrichtung konzipiert, ermöglicht umfangreiche genetische Analysen ohne spezielle Ausrüstung.
- Reproduzierbarkeit: Unempfindlich gegenüber der Intensität der Fliegenbehandlung, dem Geschlecht oder Zusätzen im Nährmedium, wodurch robuste Daten über verschiedene Bediener und Labore hinweg gewährleistet sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationaler Zusammenhang: Misst die schnelle Toleranzentwicklung, einen zentralen phänotypischen Marker für Suchtmechanismen in frühen Stadien.
- Klinische Relevanz: Erfasst die durch genetische Störungen modulierte Ethanol-Sensitivität (z. B. calnexin14D RNAi, scab, rouser, happy hour-Mutationen) mit klar nachweisbaren Richtungseffekten.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Ermöglicht eine gestufte Zielstruktur-Bewertung basierend auf der Größe und Richtung von Veränderungen in der sedativen Reaktion.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Test fügt sich in die Entdeckungskette von der Hypothesenprüfung des Targets bis zur Identifizierung von Leitsubstanzen ein und liefert eine Verhaltensvalidierung, die genetische Befunde mit funktionellen Ergebnissen in der Neuropharmakologie verbindet.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Aufklärung von Signalwegen, indem genetische Manipulationen mit messbaren Veränderungen in der Sedationskinetik durch Ethanol verknüpft werden.
- Screening: Liefert quantitative, zeitlich aufgelöste Sedationsdaten, die den Vergleich zwischen verschiedenen genetischen Bedingungen ermöglichen.
- Analytik: Gibt ST50 und AUC als normalisierte Kenngrößen für den Vergleich zwischen Bedingungen und die Auswahl von Treffern aus.
- Translationale Forschung: Schafft Bezug zur präklinischen Relevanz durch Modellierung einer schnellen Toleranzentwicklung, einem verhaltensbezogenen Vorläufer der Abhängigkeit.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Verhaltensplattform für die iterative Untersuchung genetischer und pharmakologischer Modulatoren.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten, indem ein direktes, quantifizierbares Maß für die durch Ethanol hervorgerufenen Verhaltensänderungen bereitgestellt wird.
- Operationaler Wert: Stellt Standardisierung und Reproduzierbarkeit sicher, da die Methode unempfindlich gegenüber Handhabungsvariablen und Umweltbedingungen ist.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem klare phänotypische Signale aus genetischen Störungen hervorgehen.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf der Effektgröße und -richtung bezüglich der Sedierbarkeit.
Durchführungsaspekte
- Erfordert grundlegende entomologische oder neuroverhaltenswissenschaftliche Fachkenntnisse für das Handling von Fliegen und die Bewertung der Sedierung.
- Benötigt Standardlaborausrüstung: Röhrchen, Stopfen, Zeitgeber, Ethanol-Lösung und Umweltkontrollen (20–25 °C, 55–65 % Luftfeuchtigkeit).
- Setzt standardisierte Bewertungskriterien für sedierte Fliegen (bewegungslos auf dem Boden oder auf dem Rücken) voraus, um Datenkonsistenz sicherzustellen.
- Erfordert Akklimatisierungs- und Codierschritte, um Bedienerbias zu minimieren und verblindete Tests zu ermöglichen.
- Auf die Messung der sedativen Reaktion beschränkt; erfasst keine motorische Aktivierung oder komplexen motivationalen Verhaltensweisen.
