Un test per misurare gli effetti di etanolo sulla velocità di Locomotion

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare l'effetto dell'alcol sugli organi CL di diversi genotipi in modo coerente. Questo viene realizzato prima creando un piatto di agar contenente alcol con anelli di rame incorporati nella superficie per rinchiudere gli animali. Successivamente, i diversi genotipi vengono rinchiusi separatamente ed esposti all'alcol. Durante l'esposizione, i dati video vengono raccolti in punti temporali prestabiliti.

L'ultimo passaggio è la misurazione della velocità di ogni genotipo utilizzando un software di riconoscimento degli oggetti. In definitiva, un confronto delle velocità in punti temporali precoci e tardivi viene utilizzato per scoprire una sensibilità anormale o lo sviluppo di tolleranza all'alcol. I genotipi specifici.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, che confrontano i genotipi in piastre diverse, è che la variazione ambientale è ridotta. Generalmente, gli individui che utilizzano questo metodo per la prima volta avranno difficoltà a raccogliere i vermi usando una bacchetta nuda Il giorno prima del saggio. Raccogliere L vermi di fase quattro su piastre NGM fresche Sedate con un prato di OP 50 E coli cultura, le piastre a 20 gradi Celsius durante la notte, il saggio richiede 60 per 15 millimetri standard senza sedile.

Le piastre NGM asciugano tutte le piastre da utilizzare a 37 gradi Celsius per due ore con i coperchi aperti. Ogni prova richiede quattro piastre. L'uso di piastre NGM è importante qui.

Le differenze nella composizione delle piastre. In particolare, la loro osmolarità può influenzare fortemente l'etanolo dose-responsivo sul comportamento. Questo è dovuto almeno in parte, ai cambiamenti nella quantità di etanolo accumulato dagli animali Una volta asciugati, pesa ciascuna delle piastre NGM senza sedile.

Utilizza questo peso per determinare il volume di media su ogni piastra, supponendo che il media pesi quanto l'acqua. Quindi, pianifica di sciogliere quattro anelli di rame con un diametro interno di 1,6 centimetri in ogni piastra, in modo che possano essere visualizzati dalla telecamera contemporaneamente. Utilizzando una pinzetta.

Mangia ogni anello in una fiamma per circa tre secondi e metti immediatamente l'anello sul piatto senza farlo cadere. Quindi premi delicatamente l'anello in alcuni punti per fissarlo lungo il perimetro. Etichetta le piastre con il ceppo che sarà in ogni anello.

Ora, calcola la quantità di etanolo al 100% necessaria per ottenere una concentrazione peso su volume di 400 millimolari sul piatto. Quindi carica metà delle piastre con etanolo versandolo da una pipetta. Lascia che tutte le piastre preparate si equilibrino per due ore prima di iniziare l'esperimento.

Per iniziare, impiega due minuti o meno per trasferire 10 vermi da ciascun gruppo sperimentale al centro di un anello di rame su un piatto di acclimatazione. Questo è un piatto senza etanolo. Evita di trasferire il cibo con i vermi poiché ridurrà il loro movimento.

Inoltre, evita di danneggiare la superficie dell'agar perché i vermi si scaveranno. Registra l'ora di caricamento sul piatto e assicurati di distanziare il trasferimento dei vermi su ogni piatto di oltre due minuti, in modo che ogni piatto possa essere filmato individualmente all'intervallo di tempo appropriato. Lascia che ogni piatto di acclimatazione incubi a temperatura ambiente per 30 minuti.

Quindi trasferisci i vermi sul piatto di saggio seguendo l'ordine utilizzato per posizionare i vermi sul piatto di acclimatazione utilizzando una bacchetta appiattita a bordo sottile. Raccogliere senza batteri. Raccogliere i vermi sopra la bacchetta appiattita.

Utilizzando un movimento di scavare, quindi sigilla le piastre con pellicola da laboratorio per minimizzare la perdita di etanolo a vaporizzazione. La velocità con cui gli animali vengono trasferiti in questo passaggio è molto importante perché il trasferimento agli animali sarà esposto all'etanolo più a lungo, quindi è una buona idea ruotare quali ceppi sono posizionati sul piatto. Primo attraverso repliche sperimentali.

È richiesto un microscopio con videocamera ad alta risoluzione per filmare i vermi. Ora, un'illuminazione uniforme, come quella da un retroilluminazione quadrata da tre pollici è vitale per l'analisi. Quindi per mantenere il contrasto immagine il piatto lato media in alto, prepara il software di analisi delle immagini per catturare 120.

Frame 12 bit scala di grigi time-lapse film in un fotogramma al secondo. Per ridurre la dimensione del file di output mantenendo comunque una risoluzione dell'immagine sufficiente, utilizza una modalità di piegamento due per due. Ora, registra filmati di due minuti da ogni piatto.

10 minuti dopo che gli ultimi vermi sono stati posizionati su quel piatto. Quindi esegui una seconda registrazione di due minuti. 30 minuti dopo che i vermi sono stati posizionati sul piatto per questa immagine dimostrativa.

Viene utilizzato il software Pro plus, ma una vasta gamma di altri software può essere adattata alla tecnica. Analizza i filmati come segmenti di due minuti. Innanzitutto, applica un filtro alle immagini che appiattisce lo sfondo e migliora il contrasto degli oggetti vermi.

Nel menu seleziona processo. Quindi filtri, poi miglioramento, e poi appiattisci. Imposta il parametro per uno sfondo scuro e una larghezza caratteristica di 20 pick.

Ora analizza la locomozione degli animali in ogni anello separatamente con una regione di interesse circolare che si sovrappone all'anello di rame. Identifica e traccia i vermi con il comando traccia oggetti nel sottomenu misura. Nella finestra della tabella dei dati di traccia, utilizza il pulsante delle opzioni di traccia per consentire l'esclusione di tracce specifiche e per limitare eventuali artefatti sperimentali.

Nella scheda di traccia automatica, imposta i parametri di traccia a un limite di velocità di 400 micron per fotogramma. Imposta il limite di accelerazione su automatico, imposta la lunghezza minima totale della traccia a 400 micron e imposta il tipo di movimento predominante su caotico. Quindi sotto il parametro di traccia, imposta gli oggetti per consentire tracce parziali di avere una lunghezza minima di 21 fotogrammi, e di avere una profondità di previsione di traccia di un fotogramma.

Ora per avviare il processo di traccia, clicca prima sul pulsante della funzione trova tutte le tracce automaticamente. Questo fa apparire la finestra di dialogo delle opzioni di dimensione del conteggio e la finestra di dialogo di traccia. Seleziona l'opzione manuale per la selezione dell'intervallo di intensità nella finestra di dialogo delle opzioni di dimensione del conteggio.

Questo fornisce un importante passo della soglia. Quindi regola i cursori della soglia di intensità per creare un intervallo inclusivo che evidenzia oggetti scuri. Un buon punto di partenza su una scala è tra zero e 1.500.

Ora applica un filtro di dimensione per escludere oggetti più grandi o più piccoli di un singolo verme. Vai al menu misura e poi seleziona il sottomenu misurazione. Questo apre la finestra di dialogo delle opzioni di dimensione del conteggio lì.

Imposta l'intervallo di area a 28-120.000 micrometri quadrati e imposta l'intervallo di perimetro a sei-2.500 micrometri. Apporta modifiche a questi parametri quando si utilizzano vermi di dimensioni anomale. Ora, completa il processo di traccia facendo clic.

Continua nella finestra di dialogo di traccia. Ricontrolla che le tracce di output coincidano con il filmato. Assicurati che tutti siano rappresentati a meno che non ci sia una chiara ragione per filtrarlo.

Quindi elimina manualmente le tracce prodotte da oggetti non vermi. Quindi, calcola la velocità di ogni verme mediando la distanza percorsa tra ogni fotogramma o ogni