Caratterizzazione di timica assestamento Progenitori nell'embrione mouse Uso In Vivo E In Vitro Saggi

L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare la cinetica fenotipica di generazione e il numero di cellule T prodotte dai progenitori di sedimentazione timica E 13 o E 18. Ciò si ottiene isolando prima i lobi timici da embrioni di topo E 13, E 14 ed E 18. Nella seconda fase, i lobi timici E 14 vengono irradiati e quindi colonizzati con cellule E 13 o E 18 selezionate a flusso per 48 ore in una goccia sospesa.

Nella fase finale, i lobi colonizzati vengono innestati sotto la capsula renale di topi adulti CD tre knockout. In definitiva, la citometria a flusso può essere utilizzata per valutare la presenza della progenie progenitrice di insediamento timico E 13 ed E 18 nel sangue degli animali chimerici. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai nostri metodi esistenti, come la coltura di cellule T in vitro su cellule ine so, è che questa tecnica combina i metodi che consentono la piena maturazione delle cellule T da progenitori definiti in un saggio tridimensionale con l'innesto di colture di organi timici in topi riceventi intatti, consentendo la valutazione della differenziazione e della funzione dei progenitori della fetta timica e della progenie.

In qualità di ingegnere di ricerca con esperienza nella chirurgia dei roditori, dimostrerò la procedura Due giorni prima dell'esperimento di innesto in una cappa a flusso laminare, ciò che l'addome di un topo femmina incinta con etanolo al 70% e praticare un'incisione longitudinale nella pelle sulla linea mediana, separare la pelle per aprire l'incisione e quindi utilizzare pinze e forbici per aprire il peritoneo senza toccare il tratto digestivo. Quindi, estrai l'utero bifido e usa le forbici per separarlo dalla vagina. Quindi posizionare l'utero in una capsula di Petri di 90 x 15 millimetri contenente da 40 a 50 millilitri di DPBS e tagliarlo trasversalmente tra le decidua di ciascun embrione.

Usa un paio di forbici a punta fine e una pinza fine per rimuovere la membrana muscolare dell'utero che taglia tra la placenta e il sacco vitellino per estrarre ogni embrione. Quindi rimuovere l'amnio che trattiene gli embrioni e mettere gli embrioni in una nuova capsula di Petri contenente HBSS più l'1% di FCS. Per isolare il timo, posizionare gli embrioni uno alla volta in posizione supina sotto una lente d'ingrandimento binoculare.

Quindi inserire una pinza longitudinalmente lungo la cartilagine dello sterno e pizzicare e aprire la griglia toracica utilizzando una pinza curva. Tirare da parte la parete toracica per visualizzare i lobi timici su ciascun lato della trachea. Quindi pizzicare sotto il timo con una pinza fine per rimuovere con cura ogni lobo e metterli in una capsula di Petri contenente un millilitro di HBSS più l'1% di FCS.

Quindi, usa due pinze sottili per rimuovere il tessuto connettivo circostante senza danneggiare i lobi. Quindi lavare i lobi in tre millilitri di HBSS più l'1% di FCS per eliminare i globuli rossi per iniziare l'irradiazione della coltura dell'organo timico fetale. E 14 lobi timici isolati da embrioni CD 45.2 come appena dimostrato.

Lasciate riposare i lobi per circa tre ore. Quindi centrifugare i progenitori di sedimentazione del timo E 13 o E 18 appena selezionati. Risospendere il pellet nel terreno di coltura fino a una concentrazione finale di 500 cellule per 35 microlitri di terreno.

Quindi posizionare una goccia da 35 microlitri di sospensione cellulare in ogni altro pozzetto di una piastra terasaki da 60 pozzetti e placcare un lobo irradiato sulla superficie di ciascuna goccia. Chiudere la placca e capovolgerla per far sì che le cellule raggiungano per gravità il polo apicale della goccia, colpendo delicatamente il lato superiore della placca rovesciata per costringere i lobi a scivolare verso il bordo apicale della goccia. Quindi incubare la piastra capovolta in un incubatore umidificato per 48 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Dopo che i lobi timici sono stati colonizzati, verificare il livello di anestesia dell'animale ricevente in mancanza di risposta riflessa. Quindi posizionare una goccia di unguento per gli occhi su ciascun occhio e posizionare il mouse sul lato destro sotto una cappa a flusso laminare. Quindi radere l'area chirurgica appena sopra l'articolazione della zampa posteriore.

Successivamente, eseguire un paio di guanti sterili e sterilizzare il campo chirurgico con etanolo al 70% e una soluzione DY DER al 10%. Usa un bisturi per praticare un'incisione di 1,5 centimetri attraverso il tessuto cutaneo, seguita da un'incisione attraverso il tessuto muscolare. Ora applica una leggera pressione su entrambi i lati dell'incisione per forzare il rene fuori dalla cavità addominale e mantenere il rene umido con una soluzione salina.

Mantenere il rene con un batuffolo di cotone al di fuori della cavità retroperitoneale e utilizzare due pinze sottili per praticare un foro di due o tre millimetri nella capsula. Quindi, tenendo aperta la parete della capsula, far scorrere con cautela fino a sei innesti di lobo timico sotto il bordo del polo renale e riposizionare il rene nella cavità retroperitoneale. Sutura del muscolo una nevrosi seguita da sutura cutanea con nodi individuali del chirurgo.

Quindi bagnare la ferita con una soluzione di ioduro povidone al 10% e posizionare il topo su un termoforo a 37 gradi Celsius, monitorando l'animale e la ferita chirurgica fino a quando non si sono completamente ripresi per determinare il metodo migliore per esaurire i timociti endogeni per lo sviluppo dei progenitori colonizzatori. In questo esperimento, sono stati confrontati i livelli di ricostituzione delle cellule T in un lobo timico colonizzato dopo una radiazione o un trattamento con deossi guina di cinque giorni. Sebbene al nono giorno di coltura non fosse evidente alcuna differenza nel numero di linfociti colonizzanti, i lobi irradiati contenevano più cellule T rispetto a quelli trattati con deossi guina il giorno 12, rendendo l'irradiazione il trattamento preferito per facilitare lo sviluppo delle cellule T dopo la colonizzazione timica per studiare il potenziale di sviluppo dei progenitori di insediamento timico E 13 ed E 18 qui, I lobi timici irradiati E 14 sono stati colonizzati con un numero uguale dei due tipi di progenitori come osservato, i progenitori di sedimentazione timica E 13 hanno dato origine a un minor numero di timociti e cellule T doppie positive rispetto ai progenitori di sedimentazione timoica E 18.

La frequenza di cellule C tre positive mature, tuttavia, è stata aumentata e la produzione di cellule T epiteliali dendritiche è stata rilevata solo nella progenie dei progenitori di sedimentazione timica E 13 per analizzare il potenziale in vivo dei progenitori di sedimentazione timica E 13 ed E 18 I lobi timici colonizzati con ciascun tipo di progenitori sono stati innestati sotto la capsula renale di CD tre riceventi knockout. Come appena dimostrato come previsto. I progenitori di sedimentazione timica E 13 hanno dato origine a cellule T più rapidamente rispetto ai progenitori E 18, sebbene il numero di cellule T circolanti fosse significativamente inferiore negli animali colonizzati da progenitori di sedimentazione timomica E 13 in generale Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia dello sviluppo per esplorare le proprietà del sottogruppo di cellule T, alcuni dei quali sono strettamente di origine embrionale in un modello di mammifero.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come tracciare i percorsi differenziali e funzionali dei progenitori di insediamento Timex e della loro progenie in un ambiente naturale uniforme e in condizioni competitive.