Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de Frozen Buffy Manteaux en utilisant non-intégration épisomique plasmides

L’objectif global de cette procédure est de générer des cellules souches pluripotentes induites à partir de cellules mononucléées du sang périphérique humain obtenues à partir de couches leucocytaires congelées en utilisant un protocole rentable et sans virus. Ceci est accompli d’abord par l’isolement des MNCs PB des couches leucocytaires après centrifugation du sang total sans gradient de densité, suivie d’une expansion dans un milieu de culture de sang spécifique. La deuxième étape consiste à transfecter les MNC PB de l’enveloppe leucocytaire avec des plasmides épisomaux par électroporation.

Les MNC PB transfectées sont ensuite plaquées sur des cellules embryonnaires fraîches nourricières de fibroblastes de souris. La dernière étape consiste à choisir manuellement des cellules souches pluripotentes induites dans la culture et à les transférer sur de nouvelles plaques de cellules nourricières pour l’expansion. En fin de compte, la reprogrammation efficace des MNC PB en cellules souches pluripotentes induites avec une morphologie humaine typique peut être mise en évidence par immunofluorescence et mesure de l’expression génique.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que la dégénérescence des IPC exempts de virus à partir d’OT congelés réduit les coûts, le temps de travail et les étapes manuelles pour les opérateurs pendant le traitement des échantillons. Un autre avantage de cette technique est qu’elle permet d’utiliser des TO congelés stockés dans une biobanque à grande échelle recueillie à partir d’une étude de population comme matériau source pour la production d’IPS. Commencez par prélever huit millilitres de sang périphérique veineux dans un tube en plastique tamponné au citrate de sodium.

Conservez le sang à 25 degrés Celsius et traitez-le dans les 12 heures. La première étape de traitement consiste à centrifuger le sang à 2000 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Utilisez un rotor à godet oscillant et n’appliquez pas les freins centrifuges à partir de la séparation.

Récupérez la couche chacocytaire trouble. Il s’agit de la couche située entre la phase supérieure du plasma et la phase inférieure. La couche leucocytaire est le transfert de fraction enrichi P-B-M-N-C d’environ 500 microlitres de chaque échantillon de huit millilitres dans un tube cryo-flacon.

Maintenant, Resus suspend la couche leucocytaire en ajoutant un volume égal de deux x moyen de congélation, puis congèle le flacon dans un récipient de congélation à débit contrôlé à moins 80 degrés Celsius pendant une semaine maximum. Pour un stockage plus long, les cellules peuvent être stockées dans de l’azote liquide pour commencer la décongélation. Une suspension congelée d’un millilitre de MNC PB obtenue à partir de couches leucocytaires congelées dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Diluez ensuite les cellules à deux millilitres avec du PBS.

Ensuite, déplacez la dilution dans un tube de 50 millilitres et ajoutez 10 millilitres de tampon de lyse des globules rouges. Laissez incuber ce mélange à température ambiante pendant environ 10 minutes. Après 10 minutes, augmentez le volume total à 50 millilitres avec du PBS stérile.

Ensuite, faites tourner les cellules à 300 G pendant 10 minutes à température ambiante. Après l’essorage, jetez le surnageant et lavez la pastille avec 50 millilitres de PBS. Maintenant, faites tourner à nouveau les cellules et mettez-les en suspension dans un millilitre de PBM et de milieu C.

Prélever une aliquote de cellules remises en suspension et mesurer la densité cellulaire à l’aide d’une chambre de comptage. Ajustez-le ensuite à 2 millions de cellules par millilitre. Établissez maintenant une culture de suspension.

Chargez les cellules dans un puits d’une plaque standard de 12 puits et incubez-les pendant 48 heures. Changez de support tous les deux jours, aspirez les cellules à l’aide d’une pipette et transférez-les dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugez le tube chargé à 300 GS pendant 10 minutes à température ambiante.

Ensuite, jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un millilitre de milieu frais P-B-M-N-C. Une contamination des globules rouges est habituelle pendant les premiers jours de la culture de PB MNC. Avant de remettre les cellules dans une nouvelle cellule, vérifiez-les bien sous un microscope inversé lorsqu’elles sont à environ 80 % de fluidité Co divisez la culture pendant le transfert.

Deux semaines après le début de la culture PB MNC, les cellules doivent être prêtes à être transfectées. Préparez quatre plasmides, l’un portant T trois, quatre et S-H-R-N-A contre P 53, 1 portant SOX deux et KLF quatre, un portant lmic et lin 28 et un plasmide portant EGFP. Pour commencer, collectez les MNC PB dans un tube conique de 15 millilitres et comptez le nombre de cellules viables à l’aide de triam blue.

Préparez ensuite 2 millions de cellules viables, centrifugez-les et remettez les cellules en suspension dans un mélange de transfection contenant 100 microlitres de tampon de remise en suspension T et un microgramme de chacun des quatre plasmides. Remplissez maintenant le récipient de transfection avec trois millilitres de tampon électrolytique. Deuxièmement, aspirez le mélange de transfection dans une pointe de 100 microlitres et éjectez l’échantillon verticalement dans le tube d’électroporation préparé.

Après l’électroporation, mettez les cellules en suspension dans deux millilitres de PBM d’avant-guerre et un milieu C avec 0,25 millimolaire de butyrate de sodium. Comptez ensuite le nombre de cellules viables comme précédemment et transférez la suspension dans un puits d’une plaque à six puits non revêtue. Réglez la plaque sur incuber en agitant doucement pendant 24 heures.

Conservez les cellules transfectées sans les diviser pendant trois jours à compter du jour de la transfection les jours opposés. Remplacez le milieu par deux millilitres de milieu P-B-M-N-C fraîchement préparé avec 0,25 millimolaire de butyrate de sodium un jour avant l’établissement de la co-culture, préparez la première couche de MES, les puits d’une plaque à six puits avec un millilitre de matrice de membrane basale et laissez les plaques incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, aspirez la matrice de la membrane basale et plaquez 200 000 MEF dans chaque puits avec deux millilitres de DMEM contenant 10 % de FBS le lendemain, collectez les MNC PB dans une pointe d’un millilitre.

Transférez-les dans un tube conique de 15 millilitres et faites-les tourner. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans deux millilitres de milieu frais. Ensuite, plaquez les cellules sur les puits enrobés de méthamphétamine et incubez la plaque après deux jours.

Remplacez le milieu par deux millilitres de milieu IPSC avec 0,25 millimolaire de butyrate de sodium et continuez à remplacer le milieu IPSC tous les deux jours. Après environ 22 à 25 jours, les premières colonies de I PSC devraient être visibles au bout de 30 à 35 jours. Les colonies doivent être prêtes à être cueillies et rejouées la veille de l’emballage des cellules d’alimentation de méthamphétamine des colonies IPSC sur un 12.

Plaque de puits à 125 000 cellules par puits et incubez-les pendant la nuit. Le lendemain, remplacez le milieu sur les cellules de méthamphétamine par un millilitre de milieu IPSC supplémenté. Ensuite, à l’aide d’un microscope à dissection, utilisez une aiguille pour choisir une colonie à la fois pour des colonies plus grandes qui forment de petits amas.

Transférez-les individuellement à l’aide d’une pipette, transférez une colonie dans chaque puits de la plaque enrobée de méthamphétamine et incubez la plaque jusqu’au passage. Les colonies IPSC utilisent initialement la même technique de cueillette, mais après deux ou trois passages, en utilisant la procédure enzymatique, des MNC PB isolées montrant une forme arrondie typique ont été développées dans un milieu d’hémoculture spécifique pendant 14 jours, puis transfectées avec des plasmides épisomiques 10 à 15 jours après la transfection. De petites colonies arrondies et brillantes avec des marges définies et une morphologie semblable à celle des cellules souches embryonnaires ont commencé à apparaître environ 20 à 30 jours après la transfection.

Des colonies IPSC très compactes avec des arêtes vives sont apparues et ont augmenté en taille jusqu’à ce qu’elles soient assez grandes pour être cueillies lors des premières étapes d’emballage. Les colonies IPSC ont maintenu leur état indifférencié et ont montré une morphologie typique des cellules souches embryonnaires humaines. Un grossissement accru montre les cellules individuelles au sein des colonies et le rapport nuclé/cytoplasme élevé.

Les clones IPSE sélectionnés ont été passés environ 10 à 15 fois de plus. Environ 20 phases méta de plusieurs cultures indépendantes ont été analysées pour leur stabilité génétique. Tous les échantillons ont montré un gramme normal après cinq à 10 expansions in vitro.

Ces clones ont été caractérisés par leur souche et leur pluripotence. Les clones étaient positifs pour la coloration à la phosphatase alcaline. L’analyse quantitative R-T-P-C-R a permis de vérifier que les clones exprimaient des gènes pluripotents endogènes à des niveaux beaucoup plus élevés que les MNC PB de départ.

Alors que les niveaux de cmic endogène et de KLA quatre sont restés plus ou moins les mêmes, l’expression du transgène épisomal exogène n’a pas pu être détectée dans les CPI, indiquant ainsi l’activation réussie des gènes pluripotents endogènes. Enfin, l’analyse d’immunofluorescence a révélé que les IPC exprimaient des marqueurs de pluripotence tels que OC trois quatre SSEA quatre TRA 180 1, SOX deux et TRA un 60. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des IPC à partir de ko, isolés du sang périphérique humain de manière rentable, et en utilisant des plasmides épisomaux non intégrants.