Name: Microelectrodes כפולה קנה וקונצנטריים עבור אותות המדידה של תאי יון ברקמת המוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: למד כיצד להכין ולכייל מיקרואלקטרודות יון-סלקטיביות דו-קניות וקונצנטריות למדידת ריכוזי אשלגן ונתרן ברקמת המוח. השיטה מאפשרת חקר דינמיקה יונית בתגובה לגלוטמט בפרוסות היפוקמפוס של עכבר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות ג רודריגו לקבלת סיוע טכני מומחה. אנו מודים ס קוהלר (מרכז של הדמיה מתקדמות, היינריך היה דיסלדורף האוניברסיטה) לעזרה בהפקת וידאו. מחקר במעבדה של המחבר כבר במימון הגרמני לחקר האגוד (DFG: 2,327 Ro / 8-1 לCRR), היינריך היה אוניברסיטת דיסלדורף (לNH) ועל ידי המכון הלאומי לבריאות להעניק R01NS032123 (לMC).

<ol><li>Somjen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+regulation+in+the+brain%3A+implications+for+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology.</a> Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).</li>
<li>Dietzel, I., Heinemann, U., Hofmeier, G., Lux, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-induced+changes+in+extracellular+Na%2B+and+Cl-+concentration+in+relation+to+changes+in+the+size+of+the+extracellular+space%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Stimulus-induced changes in extracellular Na+ and Cl- concentration in relation to changes in the size of the extracellular space.</a> Exp Brain Res. 46, 73-84 (1982).</li>
<li>Nicholson, C., ten Bruggencate, G., Stockle, H., Steinberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+potassium+changes+in+extracellular+microenvironment+of+cat+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Calcium and potassium changes in extracellular microenvironment of cat cerebellar cortex.</a> J Neurophysiol. 41, 1026-1039 (1978).</li>
<li>Rice, M. E., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate-+and+aspartate-induced+extracellular+potassium+and+calcium+shifts+and+their+relation+to+those+of+kainate%2C+quisqualate+and+N-methyl-D-aspartate+in+the+isolated+turtle+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glutamate- and aspartate-induced extracellular potassium and calcium shifts and their relation to those of kainate, quisqualate and N-methyl-D-aspartate in the isolated turtle cerebellum.</a> Neuroscience. 38, 295-310 (1990).</li>
<li>Prince, D. A., Lux, H. D., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+extracellular+potassium+activity+in+cat+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Measurement of extracellular potassium activity in cat cortex.</a> Brain Res. 50, 489-495 (1973).</li>
<li>Deitmer, J. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+regulation+and+proton+signalling+by+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">pH regulation and proton signalling by glial cells.</a> Prog Neurobiol. 48, 73-103 (1996).</li>
<li>Chesler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+modulation+of+pH+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Regulation and modulation of pH in the brain.</a> Physiol Rev. 83, 1183-1221 (2003).</li>
<li>Kofuji, P., Newman, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKofuji%2C+P+%22Regulation+of+potassium+by+glial+cells+in+the+central+nervous+system%22">Regulation of potassium by glial cells in the central nervous system</a>. , Springer. (2009).</li>
<li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-selective+microelectrodes+and+diffusion+measurements+as+tools+to+explore+the+brain+cell+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Ion-selective microelectrodes and diffusion measurements as tools to explore the brain cell microenvironment.</a> J Neurosci Methods. 48, 199-213 (1993).</li>
<li>Fedirko, N., Svichar, N., Chesler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+and+use+of+high-speed%2C+concentric+h%2B-+and+Ca2%2B-selective+microelectrodes+suitable+for+in+vitro+extracellular+recording%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Fabrication and use of high-speed, concentric h+- and Ca2+-selective microelectrodes suitable for in vitro extracellular recording.</a> J Neurophysiol. 96, 919-924 (2006).</li>
<li>Stephan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kir4.1+channels+mediate+a+depolarization+of+hippocampal+astrocytes+under+hyperammonemic+conditions+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Kir4.1 channels mediate a depolarization of hippocampal astrocytes under hyperammonemic conditions in situ.</a> Glia. 60, 965-978 (2012).</li>
<li>Haack, N., Rose, C. R. Preparation, Calibration and Application of Potassium-Selective Microelectrodes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaack%2C+N+%22Microelectrodes%22">Microelectrodes</a>. Lei, K. F. , Nova Science Publishers. 87-105 (2014).</li>
<li>Roos, A., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Intracellular pH.</a> Physiol Rev. 61, 296-434 (1981).</li>
<li>Kleinhans, C., Kafitz, K. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-photon+Intracellular+Sodium+Imaging+Combined+with+UV-mediated+Focal+Uncaging+of+Glutamate+in+CA1+Pyramidal+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).</li>
<li>Hertz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+astrocytic+Na+%2CK+-ATPase+and+glycogenolysis+for+K+homeostasis+in+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Roles of astrocytic Na ,K -ATPase and glycogenolysis for K homeostasis in mammalian brain.</a> J Neurosci Res. , (2014).</li>
<li>Pumain, R., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-+and+amino+acid-induced+calcium+and+potassium+changes+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Stimulus- and amino acid-induced calcium and potassium changes in rat neocortex.</a> J Neurophysiol. 53, 1-16 (1985).</li>
<li>Vargova, L., Jendelova, P., Chvatal, A., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate%2C+AMPA%2C+NMDA+Induced+Changes+in+Extracellular+Space+Volume+and+Tortuosity+in+the+Rat+Spinal+Cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Glutamate, AMPA, NMDA Induced Changes in Extracellular Space Volume and Tortuosity in the Rat Spinal Cord.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 21, 1077-1089 (2001).</li>
<li>Fellin, T., Gomez-Gonzalo, M., Gobbo, S., Carmignoto, G., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+glutamate+is+not+necessary+for+the+generation+of+epileptiform+neuronal+activity+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytic glutamate is not necessary for the generation of epileptiform neuronal activity in hippocampal slices.</a> J Neurosci. 26, 9312-9322 (2006).</li>
<li>Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astroglial+metabolic+networks+sustain+hippocampal+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission.</a> Science. 322, 1551-1555 (2008).</li>
<li>Lux, H. D., Heinemann, U., Dietzel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+changes+and+alterations+in+the+size+of+the+extracellular+space+during+epileptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Neurol%22%5BJournal%5D)">Ionic changes and alterations in the size of the extracellular space during epileptic activity.</a> Adv Neurol. 44, 619-639 (1986).</li>
<li>Zanotto, L., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartate+and+glutamate+induced+reductions+in+extracellular+free+calcium+and+sodium+concentration+in+area+CA1+of+%27in+vitro%27+hippocampal+slices+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Aspartate and glutamate induced reductions in extracellular free calcium and sodium concentration in area CA1 of 'in vitro' hippocampal slices of rats.</a> Neurosci Lett. 35, 79-84 (1983).</li>
<li>Borrelli, M. J., Carlini, W. G., Dewey, W. C., Ransom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+making+ion-selective+microelectrodes+suitable+for+intracellular+recording+in+vertebrate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for making ion-selective microelectrodes suitable for intracellular recording in vertebrate cells.</a> J Neurosci Methods. 15, 141-154 (1985).</li>
<li>Ammann, D., Anker, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutral+carrier+sodium+ion-selective+microelectrode+for+extracellular+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Neutral carrier sodium ion-selective microelectrode for extracellular studies.</a> Neurosci Lett. 57, 267-271 (1985).</li>
<li>Deitmer, J. W., Schlue, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Na%2B+and+Ca2%2B+in+leech+Retzius+neurones+during+inhibition+of+the+Na%2B-K%2B+pump%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Intracellular Na+ and Ca2+ in leech Retzius neurones during inhibition of the Na+-K+ pump.</a> Pflugers Arch. 397, 195-201 (1983).</li>
<li>Schwiening, C. J., Thomas, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+intracellular+calcium+and+its+muffling+measured+by+calcium+iontophoresis+in+snail+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationship between intracellular calcium and its muffling measured by calcium iontophoresis in snail neurones.</a> J Physiol. 491 (Pt 3), 621-633 (1996).</li>
<li>Chesler, M., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+pH+of+astrocytes+increases+rapidly+with+cortical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular pH of astrocytes increases rapidly with cortical stimulation.</a> Am J Physiol. 253, R666-R670 (1987).</li>
<li>Ammann, D., Chao, P. S., Simon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valinomycin-based+K%2B+selective+microelectrodes+with+low+electrical+membrane+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance.</a> Neurosci Lett. 74, 221-226 (1987).</li>
<li>Deitmer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicarbonate-dependent+changes+of+intracellular+sodium+and+pH+in+identified+leech+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Bicarbonate-dependent changes of intracellular sodium and pH in identified leech glial cells.</a> Pflugers Arch. 420, 584-589 (1992).</li>
<li>Lux, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+recording+ion+specific+microelectrodes%3A+their+use+in+pharmacological+studies+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Fast recording ion specific microelectrodes: their use in pharmacological studies in the CNS.</a> Neuropharmacology. 13, 509-517 (1974).</li>
<li>Nicholson, C., Phillips, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+diffusion+modified+by+tortuosity+and+volume+fraction+in+the+extracellular+microenvironment+of+the+rat+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum.</a> J Physiol. 321, 225-257 (1981).</li>
<li>Chesler, M., Chan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-induced+extracellular+pH+transients+in+the+in+vitro+turtle+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Stimulus-induced extracellular pH transients in the in vitro turtle cerebellum.</a> Neuroscience. 27, 941-948 (1988).</li>
<li>Thomas, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+sodium+activity+and+the+sodium+pump+in+snail+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular sodium activity and the sodium pump in snail neurones.</a> J Physiol. 220, 55-71 (1972).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

נוזל מבוסס ספק, אלקטרודות יון סלקטיבי כבר מועסקות בהצלחה במשך עשרות שנים וליונים רבים, חיישנים מאוד ספציפיים זמינים 22-26. כאשר נעשה שימוש במרחב תאי (ECS) של הכנות מוח חוליות, יש לזכור, עם זאת, כי מדובר בטכניקה די פולשנית: בעוד הרוחב של ECS הוא רק סביב 20-50 ננומטר, בקוטר של יון סלקטיבי microelectrodes היא כ 1 מיקרומטר (אלקטרודות הכפולה קנה) או (אלקטרודות קונצנטריים) גדולה יותר. הטיפים של microelectrodes יון סלקטיבי יהיו כך לא רק לפגוע ברקמות במהלך impalement של הרקמה, אלא גם להגדיל את ECS, העדפת הערכה נמוכה מדי של העוברים יון. למרות חסרונות אלה, ארעיים יון תאי בתגובה לפעילות עצבית בקנה אחד להפליא בין מעבדות שונות 7,8, המעידות על אמינותה של שיטה זו. ביצועים וההתאמה של אלקטרודות יון סלקטיביתלוי ברגישות שלהם וסלקטיביות, אשר מוגדרת על ידי קוקטייל החיישן (&quot;ionophore קרום הנוזלי&quot;) משמש. קוקטיילים חיישן מכילים מולקולה מיוחדת ספק, למשל valinomycin לmicroelectrodes -selective K + אשר מציגה סלקטיביות גבוהה לאשלגן 27. עם זאת, תגובה צולבת עם יונים אחרים יכולה להתרחש וחייבת להיבדק. Valinomycin מציג תגובתיות צולבת משמעותית עבור אמוניום, אשר יש לשקול בעת פירוש תוצאות (למשל 11,12). יתר על כן, בגלל המתח-התגובה של יונופורים כדלקמן התנהגות Nernstian (משוואה השווה 1), היחס וסף גילוי אות לרעש תלוי בריכוז של היון להימדד. וכך, בעוד [K +] הקטנה o ארעיים לעורר גדולים שינויי מתח נגד הבסיס הנמוך [K +] o, קטנה [Na +] o עוברת בו הרבה יותר קשה לזהות נגד הייo תחילת המחקר GH [Na +] (איור השווה 5 ו -6). הביצועים של אלקטרודות יון סלקטיבי נקבע גם על ידי ההחלטה הזמנית, הנשלטת במידה רבה על ידי קבוע זמן החשמל שלה. האחרון הוא בעיקר שנקבע על ידי ההתנגדות הצירית של החיישן, ועל ידי הקיבול המופץ לאורכו של פיפטה, בין הפתרונות הפנימיים שלה והנוזל החיצוני. בתצורה הכפולה קנה, ההתנגדות היא גבוהה, בשל הטור של חיישן יון backfilled הארוך. לדיאלקטרי נתון בידוד (בזכוכית בורוסיליקט מקרה זה), הקיבול נשלט על ידי עובי דיאלקטרי. באלקטרודות כפולות קנה, רוחב דיאלקטרי מסתכם בקיר הזכוכית של פיפטה. כזכוכית מדללת קרובה לקצה, רוחב דיאלקטרי נופל, ועליות הקיבול. גורמים אלה משלבים לייצר אלקטרודות עם זמני תגובה שנעה בין כמה מאה לכמה אלפיות השניהשניות, כגורמים אלה הם מגוונים. יתרון עיקרי של העיצוב קונצנטריים הוא ששתי ההתנגדות הצירית והקיבול לאמבטיה הינן הצטמצמו מאוד. Shunts קונצנטריים פיפטה ביותר של ההתנגדות של מחליף היונים backfilled, ומשאיר רק שריד בכמה מיקרומטרים האחרונים לפני טיפ. בנוסף, פתרון המילוי בתוך פיפטה קונצנטריים הוא הרחיק פיזי מהאמבטיה, מופרד על ידי העובי של שני קירות זכוכית, מקטין מאוד את הקיבול. כפי שניתן לראות בתחילת 10, את ההשפעה המשולבת של התנגדות וקיבול מופחתים הוא שיפור בהחלטה זמנית של שני סדרי הגודל. במקרה של Ca 2 + ו- pH microelectrodes קונצנטריים, זמני תגובה של 90% היו נמוך כמו 10-20 msec 10. יתרון נלווה של העיצוב קונצנטריים הוא הרמה נמוכה יותר רעש (איור השווה 8). בשל ההתנגדות המופחתת במידה הניכרת, ארעיים מתח מכל Ambienרעש לא הם מזערי. יתר על כן, התאוששות מארעית כזה היא מהיר, בגלל קבוע הזמן המהיר. חפצים כאלה הם אפוא קטנים ומהירים, ויש להם השפעה פחות מפריעה בהקלטות פיסיולוגיות (איור השווה 8). ישנם גם חסרונות של הטכניקה קונצנטריים. ראשית, הרכבתם היא מורכבת יותר, וזמן רב. חסרון שני הוא את הצורך בהצבה microelectrode התייחסות נפרד עם הקצה שלה, ובכך גם שימוש בmicromanipulator נפרד או מניפולטור הכפול מיוחד. לבסוף, ניתן להרחיב microelectrodes הכפולה קנה לעיצוב קנה משולש, המאפשר זיהוי של שני מיני יון שונים באותו הזמן 28, הדבר שאינו אפשרי עבור אלקטרודות קונצנטריים. מכשולים הנפוצים ביותר silanization לא יעיל. הצעד החשוב ביותר, ומכשול עיקרי בייצור של כל נוזל-sensאו microelectrode יון סלקטיבי מבוסס הוא הליך silanization. כאשר האלקטרודות אינן מגיבות לשינויים בריכוז יון ספציפי, או להגיב בתגובה תת-Nernstian (כלומר, גם פחות מ 58 mV להבדל ריכוז של פי עשרה), יעילות ירודה של silanization היא בדרך כלל הגורם. מניסיוננו, זה יכול להתרחש אם לחות באטמוספרה היא גבוהה מדי, או נמוכה מדי, אופייני לתנאים בשיאו של הקיץ, או בחורף, בהתאמה. אם זה אפשרי להפעיל שליטה מסוימת על לחות בחדר, בעיות אלה ניתן להתגבר. התנגדות האלקטרודה היא גבוהה מדי. במידת צורך, את ההתנגדות של חבית היון רגיש יכולה להיות מופחתת על ידי bevelling. לשם כך, לחשוף את הקצה שלה למטוס חזק של שוחק תלוי במים במשך כמה שניות. זה יגרום קצה עֶלִיוֹן לשבור ולהפחית את ההתנגדות לערך הרצוי. גשרי מלח. מלחגשרים בין חביות היון והתייחסות לגרום אלקטרודות גרועים או להגיב-אף ובכך יכולים גם לבלבל את הביצועים שלהם בכיול מאוד. כפי שצוין לעיל (ראה נקודה 1.6.), זה בעיקר עניין כאשר הזכוכית כפולה קנה תטא נבחרה, אך הוא תופעה נדירה בעת השימוש בטכניקת קיזוז החבית, המעוות המתוארת כאן. בקלות של ייצור במוח, העיצוב כפול קנה המקורי של Lux 29 יכול לשמש לעתים קרובות רווחי. שיטה זו מנצלת מראש מילוי חביות יון והתייחסות עם פתרונות מלח, חשיפה מהירה לפתרון silane על ידי יניקתה וגירוש מהקצה, הבאה על ידי שילוב של יון-מחליף, גם באמצעות הקצה (ראה 30,31) . יכולות להיות מפוברקות אלקטרודות אלה בכ -10 דקות, אבל גודל הקצה שלהם הוא בדרך כלל 4 מיקרומטר או יותר והם נוטים יותר להיכשל במהלך ניסוי. לעומת זאת, שיטות silanization שכרוכות בחשיפה לאדים וחום silaneING יכול לייצר אלקטרודות עם טיפים קטנים שיימשכו ימים, ולפעמים שבועות. יחדיו, יש כמה פרוטוקולים וגישות על איך להכין microelectrodes יון סלקטיבי. הנה, יש לנו תארנו שני הליכים עיקריים לייצור של microelectrodes הכפולה קנה, כמו גם קונצנטריים המעוות שפועלות היטב ובאמינות במעבדות שלנו, עם שיעור הצלחה כולל של קרוב ל 100%. חשוב לציין, בטכניקות אלה יהיו להעברה למדידה של מיני יונים אחרים, כוללים pH או סידן, וגם תהיה ישים לתכשירים אחרים מהמוח, כוללים חללים המלאים בנוזל או נוזלים באופן כללי. אחרון, אך לא פחות חשוב, microelectrodes יון סלקטיבי לאפשר קביעת ריכוזי יון בתוך תאים. בגלל גודל טיפ הגדול יחסית שלהם (~ מיקרומטר 1), רצון זה, עם זאת, יתאפשר רק בתאים עם גוף תא גדול, למשל כמו שנמצא בהכנות חוליות 28,32.

An author's middle initial was omitted from the publication, <a href="http://www.jove.com/video/53058/double-barreled-concentric-microelectrodes-for-measurement">Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue</a>. The author&#39;s name has been updated to:
Christine R. Rose
from:
Christine Rose

A correction was made to Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue.

Erratum: Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

איתות חשמלי במוח מבוסס על שטף היונים על פני ממברנות הפלזמה. תנועות יונים עיקריות לתוך החלל החוץ-תאי וממנו מתווכות לא רק על ידי מעבר דרך תעלות יונים מגודרות מתח, אלא גם על ידי קולטנים יונוטרופיים פוסט-סינפטיים כמו גם מובילי יונים. פעילות עצבית מלווה אפוא בשינויים מורכבים בריכוז החוץ-תאי של כל היונים העיקריים 1. לדוגמה, הוכח כי זרם נתרן לתאי עצב במהלך פעילות מעוררת גורם לירידה בריכוז הנתרן החוץ-תאי ([Na+]o) 2. הדבר נכון גם לגבי ריכוז הסידן החוץ-תאי מכיוון שיוני סידן נכנסים במהירות למבנים טרום-סינפטיים ופוסט-סינפטיים 3. יחד עם זאת, אשלגן נע בכיוון ההפוך וזה מתווך עלייה בריכוז האשלגן החוץ-תאי ([K+]o) בטווח הנמוך של mM 4,5. פעילות סינפטית גורמת גם לשינויים ב-pH החוץ-תאי שמתמתנים בחלקם על ידי שטפי קרום גליה מקבילים המשנים את ה-pH התוך-תאי 6,7. לשינויים אלה הקשורים לפעילות בריכוזי יונים חוץ-תאיים יש השלכות תפקודיות משמעותיות. לדוגמה, אפילו עליות קטנות ב-[K+]o מפריעות לתאי עצב כמו גם לתאי גליה ובכך משנות את הריגוש העצבי, וקיימים מספר מנגנונים להסרת עודף אשלגן 8. כישלון של אלה עלול לגרום לפעילות אפילפטית של נוירונים או לתופעות כמו התפשטות דיכאון 1. 
בגלל חשיבותם הקריטית, קביעה כמותית של ריכוזי יונים חוץ-תאיים היא לעתים קרובות הכרחית ונדרשת כדי להבין את התפקוד והתפקוד הלקוי של רשתות עצביות בתנאים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים. במשך עשרות שנים, מיקרו-אלקטרודות סלקטיביות של יונים דו-קניים הוכיחו את עצמן ככלים מצוינים למדידות כאלה ברקמת המוח 9. עבור יונים רבים, חיישנים ספציפיים מאוד עם תגובתיות צולבת נמוכה עבור יונים אחרים זמינים. בנוסף לאלקטרודות הקלאסיות הדו-קניות, הוצגו לאחרונה אלקטרודות קונצנטריות כביכול. האחרונים מספקים רזולוציית זמן מעולה, אך לוקחים קצת יותר זמן ומאמץ לבנות 10. 
להלן נתאר את ההכנה והכיול של שני סוגים אלה של מיקרו-אלקטרודות סלקטיביות יונים. לאחר מכן אנו מראים כיצד ניתן להשתמש באלקטרודות אלה בהכנות פרוסות מוח למדידת שינויים ב-[K+]o או [Na+]o המושרים על ידי פעילות מעוררת בעקבות פרדיגמות גירוי שונות כולל אמבטיה והפעלת לחץ של תרופות.

<table><tbody><tr><td>שוחקים&nbsp; &nbsp;</td><td>מיקרופוליש&nbsp;</td><td>Buehler GmbH</td><td>מומס בנימי</td></tr><tr><td>זכוכית בורוסיליקט</td><td>A.dest</td><td>1405059 הילגנברג</td><td>יישום פיפטה; 75 מ"מ x 2 מ"מ, עובי דופן 0.3 מ"מ</td></tr><tr><td>נימי זכוכית בורוסיליקט עם נימה</td><td>GC 150 F-15&nbsp;</td><td>Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus</td><td>לחיישן של מיקרואלקטרודות דו-קניות&nbsp;</td></tr><tr><td>נימי זכוכית בורוסיליקט עם נימה</td><td>GC100-F-15</td><td>Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus</td><td>לעיון של מיקרואלקטרודות דו-קניות&nbsp;</td></tr><tr><td>נימי זכוכית בורוסיליקט עם נימה</td><td>GB-200TF-15&nbsp;</td><td>מוצרי מדע</td><td>קונצנטריים, תעלה חיצונית. OD 2.0 מ"מ&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>נימי זכוכית בורוסיליקט עם נימה</td><td>GB-120TF-10</td><td>מוצרי מדע</td><td>קונצנטריים, תעלה פנימית. מגבר</td></tr> אלקטרומטר <tr><td>Digidata</td><td>1322A</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr> 1.2 מ"מ <tr><td>עם במה</td><td></td> קדמית Rin <td>בהתאמה אישית</td><td>= 10 T&Omega; ו- Ibias = 50 fA-1pA (זמין מסחרית&nbsp; חלופות: למשל Dagan IX2-700, עם headstage (נגד משוב 10 ג'יגה) או EPMS-07, NPI, Tamm, גרמניה)</td></tr><tr><td>תא</td><td></td> ניסיוני <td>בהתאמה אישית</td><td>זמין מסחרית מ-e.g. &nbsp; וורנר אינסטרומנטס, ארה"ב; &nbsp; Scientifica, בריטניה</td></tr><tr><td>תנור</td><td></td><td>הראוס</td><td>חייב להישאר קבוע ב-200 מעלות; C</td></tr><tr><td>שעווה דביקה קשה / שעווה דנטלית&nbsp;</td><td>דיבריט 502&nbsp;</td><td>סילאדנט ד"ר בוהם & Schoeps GmbH</td><td></td></tr><tr><td>Hot plate</td><td></td><td>בהתאמה אישית</td><td>חייב להישאר קבוע ב-40 מעלות; </td></tr><tr><td>C מחזיק מיקרואלקטרודות עשוי פרספקס</td><td></td><td>בהתאמה אישית</td><td>דו-חבית כפולה: OD &nbsp; נימים 1.5 מ"מ, קונצנטריים: OD&nbsp; נימים 2 מ"מ</td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td></td><td>Leitz</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>MD4R</td><td>מיקרוסקופ סטריאו Leica</td><td></td></tr><tr><td></td><td>M205C</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr>תוכנית<td>מטרה</td><td>0.8xLWD</td><td>חולץ פיפטה Leica</td><td></td></tr><tr><td></td><td>דגם PP-830</td><td>מיקרואלקטרודות קונצנטריות</td> <td>נרישיג</td>'&nbsp;</tr><tr><td>חולץ פיפטות</td><td>דגם P-97</td><td>Sutter Instruments&nbsp;</td><td>חיישן מיקרואלקטרודות קונצנטריות&nbsp;</td></tr><tr><td>מערכת פליטת תרופות פנאומטית</td><td>Picospritzter Type II</td><td>General Valve TM Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Travel Dovetail stage</td><td>DT 25/M</td><td>Thorlabs</td><td></td></tr><tr><td>דבק דו-רכיבי</td><td>&nbsp; Araldite</td><td>Huntsman חומרים מתקדמים GmbH</td><td>אפשר גם להשתמש בפס קטן של רדיד אלומיניום כדי להדביק את הנימים זה לזה&nbsp;</td></tr><tr><td>סילברווייר</td><td>99.9%&nbsp;</td><td>Wieland Edelmetalle</td><td></td></tr><tr><td>Slicer / Vibratome</td><td>Microm HM 650 V</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>AxoScope 8.1&nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>חולץ אנכי&nbsp;</td><td>סוג PE-2</td><td>Narishige מכשירים מדעיים</td><td>עם צ'אק מתגלגל עבור&nbsp; מיקרואלקטרודות דו-חביות</td></tr><tr><td>x/y שלב</td><td></td> תרגום <td>מותאם אישית</td><td></td></tr><tr><td>1(S),9(R)-(&minus;)-Bicuculline methiodide</td><td>Sigma aldrich</td><td>14343</td><td>אנטגוניסט תחרותי של קולטני GABAA (רגיש לאור); זהירות</td></tr>: <tr>אנטגוניסט קולטן<td>CNQX</td><td>Sigma aldrich</td><td>C-127</td><td>AMPA/kainate רעיל; זהירות</td></tr>: <tr><td>דימתיל סולפוקסיד רעיל (DMSO)</td><td>Sigma aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr>, <tr><td>DL-AP5</td>, <td>Alfa Aesar</td><td>J64210</td><td>אנטגוניסט לקולטן NMDA; זהירות</td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazane רעיל (HMDS)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>440191</td><td>זהירות: דליק, רעילות חריפה (דרך הפה, עור, אינהלציה) וקורוזיבי למתכות ולעור</td></tr><tr><td>חומצה L-אספרטית</td><td>Sigma aldrich</td><td>A9256</td><td>מפעיל NMDA ו-NMDA ו-EAATs</td></tr><tr><td>חומצה L-גלוטמית מלח מונוסודיום הידרט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G1626</td><td>מפעיל NMDA-R, AMPA-R, QA-R ו-KA-R),&nbsp; mGluRs ו-EAATs</td></tr><tr><td>אשלגן יונופור I - קוקטייל B</td><td>Fluka&nbsp;</td><td>60403</td><td>מבוסס על ולינומיצין; זהירות נתרן יונופור רעיל</td></tr><tr><td>II - קוקטייל A</td><td>Fluka&nbsp; &nbsp;</td><td>71178</td><td>מבוסס על מעכב ETH 157</td></tr><tr><td></td><td>TTX Ascent Scientific</td><td>Asc-055</td><td>של ערוצי Na+ תלויי מתח; זהירות</td></tr><tr><td>: מים רעילים,</td><td>סיגמא אולטרה</td> טהור <td>W3500&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

microelectrodes כפולה קנה וקונצנטריים עבור אותות המדידה של תאי יון ברקמת המוח

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

פעילות חשמלית במוח מלווה בשטפי יונים משמעותיים על פני הממברנות, וכתוצאה מכך שינויים מורכבים בריכוז החוץ-תאי של כל היונים העיקריים. מכיוון ששינויים ביונים אלה נושאים השלכות תפקודיות משמעותיות, קביעתם הכמותית נדרשת לעתים קרובות כדי להבין את התפקוד והתפקוד הלקוי של רשתות עצביות בתנאים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים. במחקר הנוכחי אנו מדגימים את הייצור והכיול של מיקרו-אלקטרודות סלקטיביות של יונים דו-קניות, שהוכחו ככלים מצוינים למדידות כאלה ברקמת המוח. יתר על כן, מתוארות גם מיקרו-אלקטרודות סלקטיביות "קונצנטריות", אשר על סמך העיצוב השונה שלהן מציעות רזולוציה זמנית טובה בהרבה של שינויי יונים מהירים. לאחר מכן אנו מראים כיצד ניתן להשתמש באלקטרודות אלה בהכנות פרוסות מוח חריפות של ההיפוקמפוס של העכבר. באמצעות מיקרו-אלקטרודות דו-קניות, סלקטיביות לאשלגן, מודגמים שינויים בריכוז האשלגן החוץ-תאי ([K+]o) בתגובה ליישום אקסוגני של אגוניסטים לקולטן גלוטמט או במהלך פעילות אפילפטית. יתר על כן, אנו מדגימים את מאפייני התגובה של אלקטרודות רגישות לנתרן, דו-חבית וקונצנטריות ומשווים את זיהוין של שינויים בריכוז הנתרן החוץ-תאי ([Na+]o) המתעוררים על ידי יישום אמבטיה או לחץ של תרופות. מדידות אלו מראות שבעוד שאמפליטודות התגובה דומות, המיקרו-אלקטרודות הנתרן הקונצנטריות מציגות יחס אות לרעש וזמן תגובה מעולים בהשוואה לעיצוב הכפול. בדרך כלל, ההליכים המודגמים יהיו ניתנים להעברה בקלות למדידה של מיני יונים אחרים, כולל pH או סידן, ויהיו ישימים גם לתכשירים אחרים.

<html> כדי לפקח [K +] o ושינויים החלימו בי בתגובה לפעילות מעוררת, microelectrode כפול קנה אשלגן סלקטיבי היה מוכנסים לתוך radiatum השכבה של אזור CA1. כמה דקות אחרי impalement, חבית יון סלקטיבי של האלקטרודה הגיעה בסיס יציב (איור 7 א), המקביל ל[ K +] o של כ -2.8 מ&quot;מ, ערך קרוב ל[ K +] של ACSF משמש ( 2.5 מ&quot;מ). יישום אמבט של גלוטמט 0.5 מ&quot;מ ל- 10 שניות גרם לעלייה הפיכה ב[ K +] o בכ -4 מ&quot;מ, ואחריו החטאה מתחת בסיס בסך של ~ 0.7 מ&quot;מ (איור 7 א). הורדת ריכוז הגלוטמט 0.4, 0.3, 0.2 מ&quot;מ וגרם לירידה מקבילה במשרעת של שתי העלייה החולפת וההחטאה ב[ K +] o (איור 7 א). OAD / 53,058 / 53058fig7.jpg &quot;/&gt; איור 7. ארעיים אשלגן תאי בתגובה לפעילות מעוררת. () [K +] o ארעיים, הכולל עלייה ואחרי החטאה מתחת תחילת המחקר, הנגרמת על ידי יישום אמבטיה של ריכוזים שונים של גלוטמט במשך 10 שניות כפי שצוין. השפעה (ב) לזלוף עם חוסמי הקולטן גלוטמט (CNQX, 100 מיקרומטר; APV, 100 מיקרומטר) וtetrodotoxin (TTX; 0.5 מיקרומטר) על [K +] o ארעיים הנגרם על ידי יישום אמבטיה של גלוטמט 0.5 מ&quot;מ ל- 10 שניות. [K +] ספונטנית (C) o ארעיים בנוכחות 0Mg 2 + / BIC. ניסויים הראו בAC בוצעו באמצעות אלקטרודות כפולות קנה. להמחשה, עקבות הוחלקו עם מסנן Sawitzky-Golay (20 מ &#39;רוחב). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig7large.jpg" target="_blank">אנא CL</a>איכס כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. ניסויים קודמים הראו כי [K +] o אותות מושרה גלוטמט כאלה לא שינו באופן משמעותי במהלך היישום של TTX, ולכן הם עצמאיים במידה רבה על פתיחת תעלות נתרן מתח מגודרת ופעולה עצבית דור פוטנציאל 15,16. כדי לחקור את המנגנונים שנצפו [K +] o השינויים בתגובה לגלוטמט, אנחנו מוחלים חוסמי הקולטן גלוטמט, כלומר CNQX (100 מיקרומטר; חוסם קולטני AMPA של) וAPV (100 מיקרומטר; חוסם של קולטני NMDA) בנוכחות TTX (0.5 מיקרומטר). על זלוף אמבטיה עם חוסמי אלה, הנגרם על-גלוטמט [K +] o שינויים היו כמעט בוטל, המאשר את תלותם בפתיחת ערוצי קולט גלוטמט ionotropic כפי שדווח בעבר (למשל 17; איור 7). כדי להדגים t נוסףהוא רלוונטי של עירור glutamatergic לדור של תאית [K +] אותות, פרוסות היו perfused עם ההלכה Mg 2 + מלח -חינם המכיל 10 מיקרומטר methiodide bicuculline (0Mg 2 + / BIC). זה מקל על Mg -block מתח תלוי 2 + של קולטני NMDA ומרטיב עיכוב על ידי חסימה קולטני GABA, גורם פעילות epileptiform חוזרת ספונטנית ברשת (למשל 18,19). כצפוי 20 [K +], ספונטנית, חוזרת ונשנית o ארעיים, בסך של כ -1.5 מ&quot;מ אותר ב0Mg 2 + / מלוח BIC (איור 7 ג). בין התגובות הללו, [K +] קטנה o ארעיים עם משרעת ממוצעת של כ 0.2 מ&quot;מ התרחש (איור 7 ג). בסט שני של ניסויים, שנהגנו [Na +] microelectrodes -sensitive לקבוע [Na +] o שינויים עוררו על ידי יישום שלאגוניסטים גלוטמט. הנה, אנחנו גם בהשוואה מאפייני התגובה של microelectrodes הכפולה קנה וקונצנטריים העסקת שתי פרדיגמות יישום שונות. [Na +] microelectrodes -sensitive הוצבו לradiatum השכבה בעומק של כ -50 מיקרומטר. לאחר תחילת המחקר יציבה הושגה, L-aspartate אגוניסט גלוטמט יושם לזלוף אמבטיה (10 מ&quot;מ, 120 שניות, זלוף אמבטיה על 2.5 מיליליטר / דקה). כפי שנצפה קודם לכן 21, יישום של aspartate גרם לירידה איטית ב[ Na +] o בכ -15 מ&quot;מ, שנמשך כ -5 דקות ולאחר מכן החל להתאושש חזרה לנקודת התחלה (8A איור). יש לציין, בזמן שאמפליטודות וקינטיקה השיא של האותות [Na +] o נקבעו על ידי שני אלקטרודות היו כמעט זהות בתנאים אלה, אלקטרודות קונצנטריים הציגו בסיס יציב יותר ורמה נמוכה יותר רעש (8 א &#39;איור). כדי לבדוק את r<html> esponse מאפיינים של אלקטרודות השונות תחת הפרדיגמה יישום מהירה יותר, אנחנו לחץ להחיל גלוטמט דרך טפטפת זכוכית עדינה ממוקם בradiatum השכבה במרחק של 20-40 מיקרומטר מקצה microelectrode יון סלקטיבי. כצפוי 21, יישום של גלוטמט (10 מ&quot;מ) עבור 200 אלפיות גרם לירידה בo [Na +] (איור 8 ב). אמפליטודות השיא של [Na +] o הירידה היו באותו הטווח לשני הסוגים של אלקטרודות (כפול-קנה: 4.5-13.5 מ&quot;מ, n = 14; קונצנטריים: 2.0-19.1 מ&quot;מ, n = 15). עם זאת, בניגוד לתוצאות שהושגו עם זלוף האיטי אמבטיה (ראה לעיל), לא רק את יחס אות לרעש, אלא גם במהלך האותות [Na +] o זוהו על ידי שני סוגים של אלקטרודות הזמן שונה משמעותי. הזמן הממוצע לשיא היה 3.5 שניות לקנה כפולות והשניות רק 1.3 לmicroelectrodes קונצנטריים. עמיתי ve_content &quot;&gt; לכן, תוצאות אלו מראות ולאשר את קינטיקה התגובה מהירה יותר של microelectrodes הכפולה קנה קונצנטריים לעומת Na + -selective, (ראה איור 6 ג ו8B), כפי שגם ציין לCa 2 + ו- pH סלקטיבי 10 . בניגוד למחקר לשעבר, שבו גירוי הסינפטי קצר פרץ בוצע לעורר ארעיים יון מהיר synaptically-induced, היה רק ​​נטייה, אבל אין הבדל משמעותי באמפליטודות שיא ממוצעת בין האלקטרודות קונצנטריים וקנה כפולים עם היישום שלנו הפרדיגמה. זה היה כנראה בשל העובדה שהמרחק של פיפטה היישום מקצה microelectrode יון סלקטיבי מגוון על ידי גורם משני (20-40 מיקרומטר), וכתוצאה מכך, שריכוז הגלוטמט המקסימאלי באזור היעד לא היה אותו הדבר בניסויים שונים, משבש כל הבדל קיימים בשיא. (א) למעלה עקבות: שינוי בוולטהGE של חביות ההתייחסות (נ&quot;צ V) של האלקטרודה כפולה קנה (זכר מנוקד שחור) ואלקטרודה קונצנטריים (זכר אפור) בתגובה לשינויים באמבטיה ריכוז Na + ([Na +] ב) כפי שצוין. שים לב שתגובות המתח של שני אלקטרודות הן כמעט זהות. עקבות תחתונה: שינויים במתח של Na -potential + (V Na +) של האלקטרודה כפולה קנה (זכר שחור) ואלקטרודה קונצנטריים (זכר אפור) בתגובה לשינויים ב[ Na +] ב. (ב) מגרשים חצי-לוגריתמים של [Na +] ב לעומת V Na + של שני אלקטרודות. מגרשים ליניארי של נתונים לחשוף שיפוע של כ -48 mV עבור שני אלקטרודות. תגובה (C) של V Na + של (זכר שחור) כפול קנה ואלקטרודה קונצנטריים (זכר אפור) לשינוי מהיר ב[ Na +] ב 152 מ&quot;מ מל -70 מ&quot;מ. שים לב שזמן התגובה של האלקטרודה קונצנטריים הוא משמעותי FASter. להמחשה, עקבות הוחלקו עם מסנן Sawitzky-Golay (רוחב 20). <img alt="איור 8" src="/files/ftp_upload/53058/53058fig8.jpg" /> איור 8: ארעיים נתרן תאי כפי שזוהה על ידי אלקטרודות כפולות קנה וקונצנטריים. (א) שינויי חלוף נ&quot;צ V ו[ Na +] o הנגרם על ידי זלוף אמבטיה עם 10 aspartate מ&quot;מ עבור 120 שניות כפי שצוין על ידי בר. העקבות העליונות מראות הקלטה שבוצעה עם אלקטרודה כפולה קנה, העקבות הנמוכות נרשמו באמצעות אלקטרודה קונצנטריים. (ב) שינויי חלוף נ&quot;צ V ו[ Na +] o הנגרמת על ידי יישום לחץ מקומי עם גלוטמט 10 מ&quot;מ 0.2 שניות כפי שצוין על ידי ראש החץ. העקבות העליונות מראות הקלטה שבוצעה עם אלקטרודה כפולה קנה, העקבות הנמוכות נרשמו באמצעות אלקטרודה קונצנטריים.קווים אדומים מנוקדים מייצגים המתאימים ליניארית של התקופה שבין תחילת האות למקסימום שלה. שים לב שזמן התגובה של האלקטרודה קונצנטריים הוא באופן משמעותי מהר יותר בתנאי זה. להמחשה, עקבות הוחלקו עם מסנן Sawitzky-Golay (רוחב 20). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

אנו מדגימים את הייצור, הכיול והתכונות של שני סוגים של מיקרו-אלקטרודות סלקטיביות ליונים (דו-חבית וקונצנטרית) למדידת ריכוזי יונים ברקמת המוח. אלה משמשים לאחר מכן בהכנת פרוסת ההיפוקמפוס של העכבר כדי להראות שפעילות מעוררת משנה הן את ריכוזי האשלגן החוץ-תאי והן את ריכוזי הנתרן.

Microelectrodes כפולה קנה וקונצנטריים עבור אותות המדידה של תאי יון ברקמת המוח

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לזהות ולנתח דינמיקה של יונים בחלל החוץ-תאי של רקמת המוח. מדידה של תהליכים יוניים חולפים (ion transients) מבוצעת באמצעות מיקרו-אלקטרודות סלקטיביות ליונים, אשר ניתן להכין על בסיס תכנון של כפול-חבית (double barreled) או תכנון קונצנטרי. כשלב ראשון, המיקרו-אלקטרודות מכויילות באמבט הניסויי.לאחר מכן, האלקטרודות מוחדרות לפרוסות אקוטיות של היפוקמפוס של עכבר לצורך הקלטה; כדי לעורר תזוזות יונים חוץ-תאיות, מספקים גלוטמט (transmitter glutamate) או אגוניסט של גלוטמט. הגלוטמט נקשר ופותח קולטנים יוניוטרופיים בקוצים פוסט-סינפטיים, מה שמאפשר זרימה של נתרן לתוך התאים וזרימה של אשלגן מחוץ לתאים. בסופו של דבר, הדבר מוביל לירידה ברמת הנתרן החוץ-תאי וכן לעלייה ברמת האשלגן החוץ-תאי, אשר מזוהים על ידי המיקרו-אלקטרודות הסלקטיביות ליונים.שיטה זו משמשת לחקר ויסות יונים חוץ-תאיים ושינויים רגעיים (transients) של ברזל המושרים על ידי פעילות במוח. כאן אנו מתארים את ההכנה והכיול של שני סוגים של מיקרו-אלקטרודות סלקטיביות ליונים. אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בהן בחתכים של רקמת מוח חיה (acute) כדי למדוד שינויים בריכוזי אשלגן או נתרן חוץ-תאיים בתגובה למתן מוליכים עצביים.הפרוצדורה תודגם על ידי Nicole Hark ו-Simon עבור המעבדה שלי. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, הכינו קפילרת זכוכית בורוסיליקט עם פילמנט לשימוש עבור גליל הרגישות ליונים, וקפילרה נוספת עבור גליל הייחוס המאוחר יותר. לאחר מכן, השתמשו בדבק דו-רכיבי או ברצועה קטנה של נייר אלומיניום כדי לקבע את הקפילרה הארוכה והקצרה יחד בשני הקצוות.חממו את הקפילריה הכפולה בתנור בטמפרטורה של 60 °C למשך שעה אחת כדי להסיר לחות שארית. לאחר מכן, אחסנו את האלקטרודות במייבש עד לשימוש. מרכזו את הקפילריה הכפולה במותח אנכי עם תפס סיבובי. השתמשו בתפס כדי למנוע התארכות של הקפילריה.יש להחזיק את הסליל בעדינות עד שהזכוכית תהיה רכה מספיק כדי לאפשר סיבוב אופקי של הריבולבר. לאחר הקירור, יש לסובב ב-180 מעלות ולהסיר את השבירה המכנית. החילו פרוטוקול חימום שני כדי למתוח את הנימירה, כך שיתקבלו שתי נימירות בעלות לוע כפול וחד.קוטר הקצה של הנימי הכפול צריך להיות קרוב למיקרון אחד. כעת מלאו את בורר הייחוס עד לקצהו במים מזוקקים כדי למנוע התנחלות של מיקרואורגניזמים. בהמשך הפרוטוקול, הניחו נימי כפול-בורר כאשר קצהו פונה כלפי מעלה על גבי מעמד בהתאמה אישית.לאחר מכן, הנח את התפסון על בקבוק בעל פיה רחבה המכיל HMDS שחומם מראש והדגר למשך 70 דקות. לאחר מכן, העבר את הקפילרה למעמד מתכת. בהמשך, הנח אותה בתנור שחומם מראש למשך שעתיים כדי לייבש את שני הגלילים לאחר הקולוניזציה, ושמור את הקפילרה יבשה בכלי ייבוש עד לשימוש.ביום הניסוי, הכין את האלקטרודה הסלקטיבית ליונים על ידי מילוי קצה הגליל הסיליקוני בשני עד שלושה µL של החיישן הסלקטיבי ליונים. לאחר מכן, מלא את הגליל מהחלק האחורי ב-100 mM sodium chloride עבור מיקרו-אלקטרודה רגישה לנתרן, או ב-100 mM potassium chloride saline עבור מיקרו-אלקטרודה רגישה לאסודיום. הקפד לא להחדיר בועות אוויר נוספות במהלך הליך זה.אם התהליך הצליח והחיישן התמלא כראוי, פני השטח של החיישן צריכים להיראות כמשטח קעור הנראה בבירור לעומת החומר הממלא (backfill). לאחר מכן, מלאו את תעלת הייחוס, הכניסו את חוטי הכסף המכלורים לשתי הקניות ואטמו כל קניה באמצעות שעוות דנטלית. בהליך זה, משכו קפילרה של 2 mm במשיכה האופקית כדי להשיג היטרוניקה (taper) קצרה וקוטר קצה של 4 µm.ממש לפני השימוש, מלאו את הנימי הסיליקוני ב-0.2 µL של החיישן. כדי להכין את הנימה הפנימית, משכו נימה בעלת קוטר קטן כך שיתקבלו שתי נימות עם קונוסים ארוכים וקצוות חדים. לאחר מכן, מלאו אותן בתמיסת מלח של 100 mM sodium chloride או 100 mM potassium chloride.הניחו את הקפילריה המלאה בחיישן ואת הקפילריה המלאה בתמיסת מלח בקו אחד זו לזו על פקק שהוקמה במיוחד מלוחיות כיסוי. הכניסו את הקפילריה הקטנה יותר באופן חלקי לתוך הקפילריה הגדולה יותר. לאחר מכן, קבעו את הקפילריות על לוחית כיסוי נוספת.בעזרת חימר למידול, העבירו את הקפילריות לבמה של מיקרוסקופ והדמיאנהן באמצעות הגדלה של 100x. בעזרת מוט זכוכית המורכב על מיקרו-מניפולטור, הניחו את הקפילריה החיצונית להתקדם לאט מעל הקפילריה הפנימית עד שהמרחק בין הקצוות שלהן יהיה כחמישה מיקרון. קבעו את הקצה הפתוח של הקפילריה החיצונית אל הקפילריה הפנימית באמצעות שעווה דנטלית והחדירו חוט כסף.להכנת אלקטרודת הייחוס, משוך קפילרית עם פילמנט במותח אנכי, השלך את הפ pipette העליונה, לאחר מכן פתח את תפסן המבט (chuck) התחתון והרם את הפ pipette התחתונה בכ-5 מילימטרים. סגור שוב את התפסן והרם אותו עד שקצה האלקטרודה התחתונה ימוקם בכ-5 מילימטרים מעל סליל החימום. לאחר מכן, חמם את הסליל והשתמש בפינצטה כדי לכופף את הקצה בזווית של כ-45 מעלות הצידה.כופפו אותו שוב בערך במינוס 45 מעלות כדי לכוון את הקצה חזרה במקביל לציר הראשי. לאחר מכן, מלאו את חבית הייחוס בתמיסת HEBS (heaps buffered saline). הכניסו לתוכה תיל כסוף מכלור (chlorinated silver wire) ואטמו את החבית באמצעות שעווה דנטלית.בשלב זה, חברו הן את האלקטרודה הרגישה ליונים והן את אלקטרודת הייחוס למיקרו-מניפולטורים והורידו אותן לתוך תא ניסוי המרוה עם A CSF. תחת מיקרוסקופ סטריאו, חברו את חוטי הכסף המכלורים לכניסות המתאימות בראש של המגבר הדיפרנציאלי. לאחר מכן, קבעו את התנגדויות האלקטרודות.לאחר מכן, כוון את אותות המתח לאפס והתחל בהקלטה לצורך כיול. לאחר קבלת קו בסיס יציב, עבור לתמיסת סלין המכילה ריכוזים מוגדרים של היון למדידה. כעת, העבר פרוסת היפוקמפוס בעובי 250 micron אל תוך תא הניסוי וקבע אותה באמצעות רשת.הורד את המיקרו-אלקטרודה הסלקטיבית ליונים שעברה כיול אל פני הפרוסה. לאחר מכן, הורד את האלקטרודה עוד כ-50 microns אל תוך ה-stratum radiatum של אזור CA1. כדי להחיל אגוניסט של מוליך עצבי, מלא את פיפטת ההחלה ב-0.5 millimolar glutamate.חברו את הפיפטה למיקרו-מניפולטור וחברו אותה למכשיר להפעלת לחץ. לאחר מכן, הורידו את פיפטת ההגשה אל תוך הרקמה והניחו אותה בזהירות בקרבת קצה המיקרו-אלקטרודה הסלקטיבית ליונים. התחילו את הפעלת הלחץ ב-40 millibars.מוצג כאן השינוי במתח של צינורות הייחוס של אלקטרודה כפולה (double barreled electrode) ואלקטרודה קונצנטרית בתגובה לשינויים בריכוז הנתרן באמבט. ואלו הם השינויים במתח של פוטנציאל הנתרן של אלקטרודה כפולה ואלקטרודה קונצנטרית בתגובה לשינויים בריכוז הנתרן באמבט. איור זה מציג גרף חצי-לוגריתמי של ריכוז הנתרן באמבט לעומת מתח פוטנציאל הנתרן של שתי האלקטרודות.הגרפים הליניאריים חושפים שיפוע של כ-48 millivolts עבור שתי האלקטרודות. להלן התגובה של אלקטרודה בעלת שתי קנים (double barreled) ואלקטרודה קונצנטרית לשינוי מהיר באמבט: ריכוז נתרן מ-152 millimolar ל-70 millimolar.שימו לב כי זמן התגובה של האלקטרודה הקונצנטרית מהיר משמעותית. איור זה מציג את התגובה החולפת של נתרן חוץ-תאי כפי שזוהתה על ידי אלקטרודות בעלות קנה כפול ואלקטרודות קונצנטריות; שינויים חולפים במתח של קני הייחוס ובריכוז הנתרן החוץ-תאי הושרו על ידי פרפוזיה של האמבט ב-10 millimolar אספרטט למשך 120 שניות, כפי שמסומן על ידי הפס. ובאיור זה, שינויים חולפים במתח של קני הייחוס ובריכוז הנתרן החוץ-תאי הושרו על ידי יישום לחץ מקומי של 10 millimolar גלוטמט למשך 0.2 שניות.שימו לב כי זמן התגובה של האלקטרודה הקונית מהיר משמעותית בתנאי זה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי השחזה נכונה היא השלב המכריע בייצור מוצלח של מיקרו-אלקטרודות סלקטיביות לברזל. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן ההכנה והשימוש באלקטרודות אלו לזיהוי ברזל חוץ-תאי חולף ברקמת מוח.

double-barreled-concentric-microelectrodes-for-measurement

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

Iontophoresis של אגוניסטים ואנטגוניסטים עצביים במהלך...

ייצור והשימוש פיגי גב Multibarrel אלקטרודות ל<em&gt; בחי</em&gt; מניפולציות תרופתיות של תגובות עצביות

סרטון זה מדגים כיצד לאפיין את החלל החוץ-תאי בפרוסת מוח באמצעות מיקרואלקטרודות סלקטיביות ויונטופורזיס כדי למדוד ולהשוות אותות חשמליים. תהליך זה מסייע לקבוע את שבר הנפח של החלל ואת מידת הפיתולים.

אפיון חלל חוץ-תאי בפרוסת מוח באמצעות מיקרואלקטרודות יונים סלקטיביות ויונטופורזיס

כאן, אנו יוצרים פיפטה מזכוכית עם פונקציות כפולות: עיכוב מבני מוח עמוקים על ידי הזרקות מיקרו של תרופות וניטור בזמן אמת של השפעותיהן באמצעות הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בו זמנית.

אלקטרו הקלטה בו זמנית ומייקרו-הזרקות של סוכנים מעכבים במוח מכרסם

טרנספורטרים בקרומי התאים מאפשרים הפרדה דיפרנציאלית של יונים על פני קרומי התאים או שכבות התאים וממלאים תפקידים מכריעים במהלך פיזיולוגיה, תיקון ופתולוגיה של רקמות. אנו מתארים את המיקרו-אלקטרודה המתייחסת לעצמה סלקטיבית של יונים המאפשרת מדידה של שטפי יונים ספציפיים בתאים ורקמות בודדות in vivo.

מדידה של תאי יון שטפי שימוש בטכניקת microelectrode העצמית התייחסות יון סלקטיבי

אנו מציגים שיטות לבניית אלקטרודות לרישום בו זמנית של פעילות עצבית חוץ-תאית ולשחרור חומרים נוירואקטיביים מרובים בקרבת אתרי ההקלטה בעכברים ערים. טכניקה זו מאפשרת ניתוח מפורט של קלטים סינפטיים מקומיים משוערים לנוירון המעניין.

הקלטה תאית של העצבית פעילות משולבת עם Microiontophoretic יישום של חומרי Neuroactive עכברי Awake

יוני אשלגן לתרום פוטנציאל ממברנה מנוחתו של תאים, ריכוז K+ חוץ-תאי הוא מווסת מכריע של הסלולר דעתנית. אנו נתאר כיצד להפוך, לכייל ולהשתמש monopolar K+-microelectrodes סלקטיבית. באמצעות אלקטרודות כזה מאפשר מדידת דינמיקה ריכוז K+ חשמלית עורר בפרוסות בהיפוקמפוס למבוגרים.

ביצוע, בדיקות ושימוש Microelectrodes סלקטיבית של יון אשלגן בפרוסות רקמת המוח למבוגרים

כאן, אנו מתארים שיטה ויוו microdialysis לניתוח שחרור אספרטט ולא גלוטמט בהיפוקמפוס הגחון של חולדות אפילפסיה ואפילפטי, בשילוב עם הקלטות EEG. חוץ-תאית ריכוזי אספרטט גלוטמט יכול להיות בקורלציה עם השלבים השונים של המחלה.

Microdialysis של חומצות אמינו מעוררות במהלך ההקלטות EEG בחופשיות העברת חולדות

פרוטוקול זה מטרתו להדגים כיצד לשלב במבחנה microelectrode מערכים להתקנים microfluidic לימוד פוטנציאל הפעולה שידור בתרבויות עצביים. ניתוח נתונים, כלומר זיהוי ואפיון של הפצת פוטנציאל פעולה, הוא שבוצעו באמצעות חדש מתקדם, אך ידידותי למשתמש, זמינה בחופשיות, כלי חישובית.

התממשקות מיקרופלואידיקה עם מערכים Microelectrode ללמוד תקשורת עצביים והתפשטות אות עצב

פרוטוקול זה מתאר הליך לבניית מערכי מיקרו-ectrode סיבי פחמן להקלטות אלקטרופיזיולוגיות כרוניות וחריפות ב- vivo בעכבר(שרירים)וחמוס(Mustela putorius furo) מאזורי מוח מרובים. כל שלב, לאחר רכישת סיבי פחמן גולמיים להשתלת מערך microelectrode, מתואר בפירוט, בדגש על בניית מערך microelectrode.

הקמה ויישום של מערכי מיקרו-ectrode סיבי פחמן להקלטות כרוניות וחריפות ב-Vivo

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את בנייתם של מערכי מיקרו-אלקטרוניקה מותאמים אישית לתיעוד פוטנציאל שדה מקומי in vivo ממבנים מוחיים מרובים בו-זמנית.

בניית מיקרו-אלקטרוניקה פוטנציאלית לשדה מקומי עבור הקלטות in vivo ממבני מוח מרובים בו זמנית

מערכת הקלטה אלקטרואנצפלוגרפית בעלות נמוכה בשילוב עם סליל בגודל מילימטר מוצעת להניע גירוי מגנטי טרנס-גולגולתי של מוח העכבר in vivo. באמצעות אלקטרודות בורג קונבנציונליות עם מצע מערך מותאם אישית, גמיש ורב-אלקטרודות, ניתן לבצע הקלטה מרובת אתרים ממוח העכבר בתגובה לגירוי מגנטי טרנס-גולגולתי.

מערכת הקלטה אלקטרואנצפלוגרפית בעלות נמוכה בשילוב עם סליל בגודל מילימטר כדי לגרות באופן טרנס-גולגולתי את מוח העכבר in vivo

למד כיצד להכין ולכייל מיקרואלקטרודות יון-סלקטיביות דו-קניות וקונצנטריות למדידת ריכוזי אשלגן ונתרן ברקמת המוח. השיטה מאפשרת חקר דינמיקה יונית בתגובה לגלוטמט בפרוסות היפוקמפוס של עכבר.

Microelectrodes כפולה קנה וקונצנטריים עבור אותות המדידה של תאי יון ברקמת המוח

גלה סרטונים נוספים